Головна Лікарські засоби Про діагностику спадкових хвороб обміну речовин у дітей методом тандемної мас-спектрометрії на території свердловської області. Сучасні проблеми науки та освіти Як підготувати малюка до дослідження

Про діагностику спадкових хвороб обміну речовин у дітей методом тандемної мас-спектрометрії на території свердловської області. Сучасні проблеми науки та освіти Як підготувати малюка до дослідження

Тандемна мас-спектрометрія - один із сучасних методіваналізу сполук, який широко використовується для різних наукових і практичних цілей. Цей метод дозволяє проводити аналіз кількох сотень сполук у мікрокількості біологічного матеріалу. У світовій практиці охорони здоров'я цей метод використовують щодо масового скринінгу новонароджених на спадкові хвороби обміну речовин (НБО). У плямі висушеної крові можливе визначення амінокислот (у тому числі і фенілаланіну) та ацилкарнітинів. Кількісне визначення цих речовин дозволяє виключати кілька десятків спадкових захворювань, що належать до різних класів НБО (порушення метаболізму амінокислот, органічних кислотта дефектів мітохондріального b-окислення жирних кислот). Раніше для діагностики цих порушень була потрібна велика кількість біологічного матеріалу, проведення кількох досліджень (амінокислотний аналіз, хроматомас-спектрометрія, визначення спектру ацилкарнітинів), що вимагало значного часу та матеріальних витрат. ТМС дозволяє кількісно визначити всі ці сполуки протягом одного аналізу! Спадкові порушення метаболізму амінокислот, органічних кислот та дефектів мітохондріального бета-окислення жирних кислот налічують близько 100 нозологічних форм, більшість з яких маніфестує у неонатальному періоді. Їхня частота становить понад 1:5000 живих новонароджених. Багато лікарів помилково вважають, що захворювання цієї групи зустрічаються так рідко, що виключати їх потрібно лише в останню чергу, і дуже часто правильний діагноз встановлюється вже на пізніх термінах або захворювання взагалі не діагностується.

При проведенні аналізу визначається 52 показники (амінокислоти та ацилкарніни)

4, 1

1 ФДБУ «Медико-генетичний науковий центр» РАМН

2 ГБОУ ВПО «Ростовський державний медичний університет МОЗ Росії»

3 ДБУЗ "Краєва клінічна лікарня № 1 ім. професора С.В.Очаповського" департаменту охорони здоров'я Краснодарського краю

4 ФДБУ “Медико-генетичний науковий центр”

З метою обґрунтування впровадження масового обстеження новонароджених на спадкові хвороби обміну (НБО) методом тандемної мас-спектрометрії (МС/МС) проведено ретроспективне дослідження архівних зразків крові дітей (n=86), які померли на першому році життя. Зміни профілів амінокислот та ацилкарнітинів виявлено у 4 випадках (4,7 %). В одному з них виявлено специфічне для хвороби запаху сечі кленового сиропу багаторазове підвищення концентрації лейцину, ізолейцину та валіну. Клінічна картина та виявлення мутації у першому екзоні гена BCKDHB (с.98delG) у гетерозиготному стані опосередковано підтвердили діагноз лейцинозу. В інших трьох випадках виявлені зміни профілю амінокислот та ацилкарнітинів не мають такого ж специфічного характеру. У цих випадках були б необхідні повторні дослідження крові методом МС/МС, додаткові клінічні та біохімічні дослідження. В результаті проведеного дослідження підтверджено необхідність впровадження методу МС/МС у програми неонатального скринінгу на НБО для їх своєчасної діагностики та лікування.

ретроспективна діагностика

тандемна мас-спектрометрія

спадкові хвороби обміну

1. Краснопільська К. Д. Спадкові хвороби обміну речовин. Довідковий посібник для лікарів. – М.: РГО «Центр соціальної адаптації та реабілітації дітей «Фохат», 2005. – 364 с.

2. Михайлова С. В., Захарова Є. Ю., Петрухін А. С. Нейрометаболічні захворювання у дітей та підлітків. Діагностика та підходи до лікування. – М.: «Літерра», 2011. – 352 с.

3. Chace H. D. Rapid diagnosis з MCAD хитромудрою цитатою octanoylcarnitine та інших acylcarnitines в новому блоці шлунка при тандему маси спектрометрії / Chace H. D., Hillman S. L., Van Hove J. L. et al. // Clinical Chemistry. – 1997. – V. 43. – № 11. – Р. 2106-2113.

4. Nyhan L. W., Barshop B. A., Ozand P. T. Atlas of metabolic diseases. - Second edition. - London: Hodder Arnold, 2005. - 788 p.

5. Rashed M. S. Clinical application of tandem mass spectrometry: 1 years diagnosis and screening for inherited metabolic diseases // J. of Chrom. B. – 2001. – V. 758. – № 27-48.

6. Sweetman L. Naming і counting disorders (counditions) входять в нове скріншення panels / Sweetman L., Millington D. S., Therrell B. L. et al. // Pediatrics. – 2006. – V. 117. – P. 308-314.

7. Van Hove J. L. Medium-chain acl-CoA дегідрогенас нездатності: diagnosis з acylcarnititne analysis in blood/Van Hove JL, Zhang W., Kahler S. G. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 1993. – V. 52. – P. 958-966.

Вступ

На сьогоднішній день відомо понад 500 нозологічних форм спадкових хвороб обміну (НБО). Основна частина НБО зустрічається вкрай рідко, але їхня сумарна частота в популяції становить 1:1000-1:5000. Як правило, НБО маніфестують на першому році життя неспецифічними симптомами, що клінічно маскують їх під іншу, неспадкову соматичну патологію. Разом з тим, своєчасна діагностика метаболічних спадкових захворювань важлива, оскільки для багатьох з них розроблені та продовжують розроблятися ефективні методипатогенетичного лікування, без якого результат захворювань найчастіше залишається фатальним. Загальновизнано, що одним із найбільш виправданих та ефективних підходів до раннього виявлення спадкової патології є неонатальний генетичний скринінг. Розвиток методу тандемної мас-спектрометрії (МС/МС) з електроспрейною іонізацією зробив великомасштабний мас-спектрометричний скринінг застосовним у практиці масового обстеження на НБО до кінця 90-х років ХХ століття. Цей високочутливий мікрометод дозволяє одночасно визначати у кількох мікролітрах крові концентрації десятків амінокислот та ацилкарнітинів, що мають значення для діагностики НБО. Ефективність лабораторного тесту МС/МС дозволила включити його до державних програм неонатального скринінгу новонароджених дітей на аміноацидопатії, органічні ацидурії та дефекти мітохондріального β-окислення жирних кислот у ряді країн. Тим не менш, у Російської ФедераціїМетод МС/МС не впроваджено систему масового обстеження новонароджених дітей і доступний для селективного скринінгу на НБО лише у поодиноких федеральних медичних центрах.

Метою даного дослідження стало наукове обґрунтування необхідності включення до регіональних програм масового обстеження новонароджених дітей досліджень методом МС/МС для діагностики аміноацидопатій, органічних ацидурій та дефектів мітохондріального β-окислення жирних кислот на основі проведення ретроспективного мас-спектрометричного аналізу зразків крові хворих дітей, захворювання летальним кінцем на першому році життя.

Пацієнти та методи дослідження

В даний час ретроспективне дослідження включені діти (n=86, співвідношення хлопчики: дівчатка 48/38), які померли на першому році життя (у віці від 5 діб до 11 місяців життя) протягом одного календарного року (2010 рік) на адміністративній території Краснодарського краю . У дослідження включені діти з вродженими вадами розвитку (n=29), інфекційними захворюваннями - пневмонія, сепсис, бактеріальний менінгоенцефаліт (n=37), перинатальним ураженням ЦНС (n=11), синдромом раптової смерті (n=6) та іншими захворюваннями ( n = 3). Контрольну групу склали 438 клінічно здорових новонароджених дітей (227 дівчаток, 211 хлопчиків) віком 3-8 днів. У цій групі було визначено референсні значення концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у капілярній крові у здорових дітей періоду новонародженості.

Матеріалом дослідження послужили архівні зразки периферичної крові на стандартних паперових тест-бланках, отримані на 3-8 день життя, щодо стандартного неонатального скринінгу. Концентрацію амінокислот та ацилкарнітинів (табл. 1) у крові визначали методом тандемної мас-спектрометрії (МС/МС) за допомогою квадрупольного тандемного мас-спектрометра Agilent 6410 (AgilentTechnologies, США) за сертифікованою методикою компанії CHROMSYSTEM № V0. виконано у лабораторії медичної генетики ДБОУ ВПО «Ростовський державний медичний інститут МОЗ Росії».

Таблиця 1

Метаболіти, що визначаються методом МС/МС

	Метаболіт	Умовне позначення	Метаболіт	Умовне позначення
*Амінокіслоти*
			3-метилкротонілкарнтин
	Аспарагінова кислота		3-гідроксиізовалерилкарнітин
	Глутамінова кислота		Гексаноїлкарнітин
	Лейцин+ізолейцин		Октаноїлкарнітин
	Метіонін		Октеноілкарнітін
	Фенілаланін		Деканоїлкарнітин
			Деценоїлкарнітин
			Додеканоїлкарнітин
			Мирістілкарнітін
	Цитрулін		Тетрадеценоілкарнітін
			Тетрадециноїлкарнітин
			Гідроксимирістілкарнтін
*А ц і л к а р н і т і ни*			Пальмітоїлкарнітин
	Вільний карнітин		Гексадеценоїлкарнітин
	Ацетилкарнітин		Гідроксигексадеценоілкарнітін
	Пропіонілкарнітин		Гідроксипальмітоїлкарнітин
	Малонілкарнітін		Стеароїлкарнітин
	Бутирілкарнтін		Олеоілкарнітін
	Метилмалонілкарнітин		Гідроксистеароілкарнітін
	Ізовалерілкарнтин		Гідроксіолеоілкарнітин
	Глутарілкарнітін		Гідроксиноілкарнітин

Статистична обробка даних проводилася з використанням пакету прикладних програм Statistica 6,0 та електронних таблиць Excel 2007. Для визначення описових числових характеристик змінних застосовувалися стандартні методики статистичного аналізу: розрахунок медіани, 0,5 та 99,5 перцентилів.

Для підтверджуючої молекулярно-генетичної діагностики лейцинозу проводили виділення ДНК із сухих плям крові, використовуючи набір реактивів DiatomDNAPrep (ТОВ Біоком, Росія). Підбір праймерів для ПЛР ампліфікації здійснювали для 10 екзонів генів BCKDHA та BCKDHB. Секвенування ПЛР-фрагментів для виявлення рідкісних мутацій проводилося згідно з протоколом фірми-виробника на генетичному аналізаторі ABIPrism 3500 (AppliedBiosystem, США).

Результати дослідження та їх обговорення

В результаті дослідження концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у периферичній крові 438 клінічно здорових новонароджених дітей було визначено 0,5 та 99,5 перцентіліконцентрацій досліджених метаболітів, які використовувалися нами надалі як референсні значення (табл. 2). Зіставлення концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів, визначених у зразках крові 86 померлих на першому році життя дітей, з референсними значеннями концентрацій, показало, що у 82 пацієнтів (95,3 %) жоден із досліджуваних показників не виходив за межі 0,5 та 99, 5 перцентилів контрольної групи, що дозволило відмовитися від робочої версії про наявність у них порушень обміну амінокислот та карнітинів, які не верифіковані прижиттєво. Однак у 4 дітей (4,7%) концентрації деяких амінокислот та ацилкарнітинів у кілька разів перевищували верхні межі референсного інтервалу контрольної групи (табл. 2).

Таблиця 2

Результати ретроспективної оцінки концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у новонароджених (n=4) з рівнем окремих метаболітів поза діапазоном 0,5-99,5 перцентилів

	Метаболіти	Концентрації окремих метаболітів (мкмоль/л)
		Референсні значення контрольної групи (n=438) в діапазоні 0,5-99,5 перцентил	Індивідуальні значення пацієнтів (n=4)
			Пацієнт 1	Пацієнт 2	Пацієнт 3	Пацієнт 4
*Амінокіслоти*



			2503,868






						1457,474

*А ц і л к а р н і т і ни*

* Примітка:

Пацієнт 1 – хлопчик КМ (діагноз: обструктивний бронхіоліт), помер у віці 11 місяців;

Пацієнт 2 – хлопчик КФ (діагноз: пневмонія), помер у віці 1 місяця;

Пацієнт 3 – дівчинка ЛВ (діагноз: сепсис), помер у віці 12 діб.

Пацієнт 4 – дівчинка ПА (діагноз: пневмонія), померла у віці 6 діб.

У першому випадку у пацієнта КМ, який помер у віці 11 місяців, з діагнозом обструктивний бронхіоліт, тандемна мас-спектрометрія амінокислот і ацилкарнітинів в архівних зразках крові виявила зміни вмісту лейцину, ізолейцину та валіну, які носять досить специфічний характер. метаболічного дефекту в дорозі катаболізму лейцину та ізолейцину. У досліджених архівних зразках крові виявлено збільшення концентрації лейцину та ізолейцину більш ніж у 9 разів та валіну – більш ніж у 3 рази порівняно з референсними значеннями, що дозволяє припустити діагноз «хвороби із запахом сечі кленового сиропу».

З наявних клінічних даних на користь лейцинозу у дитини КМ свідчили наступні клінічні прояви: рання відмова від природного вигодовування, симптоми неонатальної енцефалопатії, наростання неврологічної симптоматики – зміни м'язового тонусу, судоми, епілепсія, затримка психомоторного розвитку. У дитини часто спостерігалися інфекційні захворювання дихальних шляхів з тяжким перебігом, які стали причиною облітеруючого бронхіоліту, що спричинив смерть у віці 11 місяців. Ми не маємо інформації про те, чи був у дитини специфічний запах сечі, але збільшення концентрації типових для лейцинозу метаболітів та характерна клінічна симптоматика підтверджують наше припущення. Крім того, на користь діагнозу хвороби запаху сечі кленового сиропу свідчать результати проведеної діагностики ДНК лейцинозу з використанням архівних зразків крові. Молекулярно-генетичний аналіз дозволив виявити у дитини делецію с.98delG у першому екзоні гена BCKDHB у гетерозиготному стані. Ця ж мутація виявлена у крові матері. З огляду на обмежену кількість архівних зразків крові дитини та недоступність біологічного матеріалу її батька другу мутацію виявити не вдалося. Тим не менш, сукупність клінічних, біохімічних та молекулярно-генетичних даних підтверджують діагноз лейцинозу (або хвороби із запахом сечі кленового сиропу, MIM ID 248600) у вивченому випадку.

В інших трьох випадках виявлені зміни профілю амінокислот та ацилкарнітинів не мають такого ж специфічного характеру, як у попередньому випадку. Припускати певні НБО, ґрунтуючись на даних МС/МС, тим більше – затверджувати з достовірністю, у цих випадках неможливо. Для диференціальної діагностики аміноацидопатій та органічних ацидурій необхідні були б повторні дослідження крові методом МС/МС, додаткові клінічні та біохімічні дослідження.

Ступінь підвищення специфічних для захворювань метаболітів варіабельний і залежить від багатьох факторів. Характер харчування дитини, прийом деяких лікарських препаратівповинні враховуватися під час інтерпретації результатів. Так, прийом препаратів, що містять вальпроєву кислоту або середньоланцюгові тригліцериди, призводить до підвищення С6, С8 та С10, що ускладнює діагностику недостатності середньоланцюгової ацил-КоАдегідрогенази. Прийом лікарських препаратів, що містять карнітин, також може призводити до підвищення концентрацій коротко- і середньоланцюжкових ацилкарнітинів. Вміст довголанцюгових ацилкарнітинів у плазмі та цільній крові по-різному, оскільки вони асоційовані з мембранами еритроцитів, отже, показник гематокриту має певне значення. За деяким винятком, півтора – дворазове збільшення концентрації потребує повторного аналізу крові. Так, патогномонічні для пропіонової та ізовалеріанової ацидурії рівні метаболітів зазвичай підвищуються більш ніж у 5 разів, а навіть незначна зміна концентрації глутарилкарнітину вимагає не тільки повторного аналізу крові, але й додаткового дослідження органічних кислот сечі, характерних для глутарової ацидурії I типу.

Висновок

Проведене методом МС/МС ретроспективне дослідження зразків крові дітей раннього віку, що померли від різних причин, дозволило припустити у ряді випадків спадкову патологію обміну речовин. В одному з них підтверджено діагноз хвороби запах сечі кленового сиропу (лейциноз). Своєчасні діагностичні заходи в подібних випадках є важливою складовою в диференціальної діагностикиуроджених помилок метаболізму. Дослідження концентрацій амінокислот та ацилкарнітинів у зразках біологічних рідин може мати діагностичну цінність в аналізі випадків дитячої смертності. Посмертно встановлений діагноз спадкового захворювання на обмін речовин у померлої дитини є показанням для медико-генетичного консультування сім'ї. Необхідне широке впровадження методу МС/МС у неонатальний скринінг як основного інструменту для виявлення аміноацидопатій, органічних ацидемій та дефектів β-мітохондріального окиснення жирних кислот у новонароджених для своєчасної діагностики та лікування НБО.

Рецензенти:

Полевиченко Олена Володимирівна, д-р мед. наук, професор, головний науковий співробітник відділу реабілітації та медико-соціальної допомоги ФДБУ «ФНКЦ дитячої гематології, онкології та імунології імені Дмитра Рогачова» МОЗ Росії, м. Москва.

Михайлова Світлана Віталіївна, д-р мед. наук, завідувач відділення медичної генетики ФДБУ «Російська дитяча клінічна лікарня МОЗ Росії», м. Москва.

Бібліографічне посилання

Байдакова Г.В., Антонець А.В., Голіхіна Т.А., Матулевич С.А., Амеліна С.С., Куцев С.І., Куцев С.І. РЕТРОСПЕКТИВНА ДІАГНОСТИКА СПАДЧИХ ХВОРОБ ОБМІНУ МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЇ МАС-СПЕКТРОМЕТРІЇ // Сучасні проблеминауки та освіти. - 2013. - № 2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=8953 (дата звернення: 12.12.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства»

За даними огляду, надрукованого в Clinical Biochemist Reviews, застосування високоефективної рідинної хроматографії у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС/МС) у клінічних лабораторіях надзвичайно зросло протягом останніх 10-12 років. Автори відзначають, що специфічність аналізу ВЕРХ-МС/МС значно перевершує імунологічні методи і класичну високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) при аналізі молекул з низькою молекулярною вагою і має значно більшу продуктивність, ніж газова хроматографія-мас-спектрометрія. Популярність цього при рутинних клінічних аналізах нині пояснюється унікальними можливостями методу.

Можливість точного кількісного аналізу малих молекул;
Одночасний аналіз множини цільових сполук;
Унікальна специфічність;
Висока швидкість аналізу.

В останні роки багато уваги приділяється часу аналізу і, як наслідок, підвищенню продуктивності лабораторії. Значне скорочення часу аналізу стало можливим завдяки застосуванню коротких аналітичних колонок для ВЕРХ/МС/МС, що одночасно різко збільшило специфічність аналізу. Використання методу іонізації при атмосферному тиску (API), тандемного потрійного квадрупольного мас-спектрометра та вдосконаленої високоефективної рідинної хроматографії, а також відповідних методів підготовки зразків, привели ВЕРХ-МС/МС у перші ряди сучасних аналітичних методів.

Отримання повного профілю метаболізму стероїдів (steroids panels), пуринів та піримідинів та інших сполук,
скринінг новонароджених на вроджені помилки метаболізму (виявлення кількох десятків захворювань за аналіз);
Терапевтичний моніторинг лікарських препаратів — імунодепресантів, перотивосудомних, антиретровірусних, антикоагулянтів та будь-яких інших – незалежно від наявності наборів виробника. Не потрібно купувати дорогі набори кожної речовини – можна розробляти власні методики;
Клінічна токсикологія – аналіз понад 500 наркотичних сполук та їх метаболітів за один аналіз, без підтверджуючого аналізу
протеоміка та метаболоміка.

Крім того, ВЕРХ-МСМС використовується для скринінгу олігосахаридового в сечі, сульфатиду, довжиноланцюгових жирних кислот, довжиноланцюгових жовчних кислот, метилмалонової кислоти, дослідження порфірій, скринінгу пацієнтів з порушеннями пуринового та піримідинового метаболізму.

Приклади застосування рідинної хроматографії
у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією у клінічних аналізах.

Скринінг новонароджених:Першим прикладом масового застосування ВЕРХ-МС/МС у клінічній діагностиці був скринінг вроджених помилок метаболізму у новонароджених. В даний час у розвинених країнце рутинний метод і охоплює більше 30 різних захворювань, включаючи ацедемії, аміноацидопатії, дефекти окислення жирних кислот. Слід особливо відзначити дослідження вроджених дефектів, які можуть призвести до серйозних проблем, якщо не вжити негайних заходів (наприклад, збільшені серце або печінка або набряк мозку). Перевагою використання ВЕРХ-МС/МС для скринінгу новонароджених є можливість одночасно аналізу всіх амінокислот та ацилкарнітинів швидким, недорогим та високоспецифічним методом.

Терапевтичний моніторинг лікарських засобів:Розробка та впровадження імунодепресанту сиролімусу (рапаміцин) для запобігання відторгненню органів після трансплантації була одним із основних стимулів впровадження ВЕРХ-МС/МС у клінічні лабораторії. Сучасний метод ВЕРХ-МС/МС дає можливість одночасного визначення такролімусу, сиролімусу, циклоспорину, еверолімусу та мікофенойної кислоти.

ВЕРХ-МС/МС застосовується також для аналізу цитотоксичних, антиретровірусних лікарських речовин, трициклічних антидепресантів, антиконвульсантів та інших препаратів, що потребують індивідуального дозування.

Метод ВЕРХ-МСМС дозволяє розділити та кількісно визначити R- та S-енантіомери варфарину в діапазоні концентрацій 0.1-500 нг/мл.

Наркотичні та болезаспокійливі речовини:ВЕРХ-МС/МС широко застосовується для аналізу цих сполук завдяки простоті пробопідготовки та малому часу аналізу. В даний час метод використовується в клінічних лабораторіях для скринінгу на наявність широкого спектра наркотичних речовин. Унікальна специфічність та чутливість методу дає можливість одночасного аналізу понад 500 сполук різних класів в одній пробі з мінімальною пробопідготовкою. Так, у разі аналізу сечі досить простого розведення проби в 50-100 разів. При аналізі волосся замість пучка 100-200 волосся для достовірного виявлення фактів споживання наркотичних засобів досить одиничного волосся.

Ендокринологія та аналіз стероїдів:ВЕРХ-МС/МС широко застосовується в багатьох ендокринологічних лабораторіях для аналізу стероїдів – тестостерону, кортизолу, альдестерону, прогестерону, естріолу та багатьох інших.

Дедалі більше лабораторій починають використовувати ВЕРХ-МС/МС визначення рівня у крові вітаміну Д3 і Д2.

I. Визначення стероїдів (steroid profile).

Лабораторії при лікарнях та клініках нині мають можливість проводити за допомогою ВЕРХ/МС/МС одночасне визначення кількох стероїдів. При цьому немає потреби у великому обсязі зразка, що особливо важливо при аналізах дитячих зразків.

ІІ. Визначення тиреоїдних гормонів

Рутинні методи визначення тиреоїдних гормонів зазвичай засновані на радіоімуноаналізі, який є дорогим і дозволяє визначати тільки Т3 та Т4, що може обмежувати можливості визначення та повного регулювання функцій щитовидної залози.

В даний час при використанні ВЕРХ-МСМС проводиться одночасний аналіз у зразках сироватки крові п'яти тиреоїдних гормонів, включаючи тироксин (Т4), 3,3′,5-трииодотиронин (Т3), 3,3′,5′- (rT3), 3 ,3'- дііодотиронін (3,3'-T2) та 3,5-дііодотиронін (3,5-T2) в діапазоні концентрацій 1 -500 нг/мл.
Метод ВЕРХ/МС/МС застосовується також для аналізу складу гормонів пацієнтів, які пройшли тиреоїдектомію. Визначаються рівні концентрацій тироксину (Т4), трійодотіроніна (Т3), вільного Т4 і тиреоїд стимулюючого гормону (ТSH) після операції. Встановлено, що ВЕРХ/МС/МС є чудовим способом встановлення взаємозв'язку між ТSH та концентраціями тиреоїдних гормонів.
Метод ВЕРХ/МС/МС був застосований для визначення тироксину (Т4) у слині та сироватці крові людини. Метод відрізняється високою відтворюваністю, точністю та межею виявлення 25 пкг/мл. Проведені дослідження показали, що існує діагностична залежність у концентраціях Т4 у слині між еутиреоїдними випробуваними та пацієнтами з хворобою Грейвса.

Метод ВЕРХ/МС/МС в даний час має чутливість, специфічність і точність, необхідних для надійного визначення всіх стероїдів в біологічних рідинах і таким чином підвищує діагностичні можливості, особливо у разі визначення наборів стероїдів.

ІІІ. Визначення 25-оксівітаміну Д методом ВЕРХ/МС/МС

25-окси вітамін Д (25ОД) є основною циркулюючою формою вітаміну Д і попередником його активної форми. (1,25-діоксівітамін Д). Зважаючи на тривалий період його напіввиведення, визначення 25ОД важливе для визначення статусу вітаміну Д в організмі пацієнта. Вітамін Д існує у двох формах: вітамін Д3 (холекальциферол) та вітамін Д2 (ергокальциферол). Обидві форми метаболізують у відповідні 25ОД форми. Дуже велике значення для діагностики має наявність аналітичних методів, які можуть визначати з високою точністю обидві форми вітаміну і дозволяють проводити моніторинг пацієнтів з порушеннями вмісту вітаміну Д. Застосовувані методи досі не дозволяли проводити роздільне визначення вітаміну Д2 і Д3. Крім того, при високих концентраціях вітаміну Д2 занижується кількість Д3, що визначається. Іншим недоліком є застосування радіоактивних ізотопів. Застосування методу ВЕРХ/МС/МС дозволило уникнути застосування радіоактивних ізотопів, а й проводити роздільне визначення обох активних форм вітаміну.

При підозрі на зниження вмісту вітаміну Д в організмі;
При підозрі на незрозумілий токсичний вплив;
При обстеженні пацієнтів, які проходили курс лікування щодо зниженого вмісту вітаміну Д;
Використання ВЕРХ/МС/МС дозволило проводити окреме визначення обох форм моніторингу пацієнтів.

IV. Визначення імунодепресантів методом ВЕРХ/МС/МС

Після трансплантації органів необхідно приймати імунодепресанти протягом усього життя, щоб уникнути реакції відторгнення. Маючи дуже вузький терапевтичний діапазон і високу токсичність, імунодепресанти вимагають індивідуального дозування для досягнення максимального ефекту. Тому життєво важливим є моніторинг основних імунодепресантів: циклоспорину А, такролімусу, сиролімусу та еверолімусу для регулювання дози ліків для кожного індивідуального пацієнта залежно від концентрації препарату в крові.

Імуноаналіз все ще використовується для моніторингу перелічених лікарських препаратів, проте ці методи дорогі та їх специфічність, точність та відтворюваність обмежені. Відомі випадки загибелі пацієнтів від неправильного дозування імунодепресантів, що ґрунтуються на результатах, отриманих за допомогою імунологічних методів. Нині імуноаналізи замінюються у клінічних лабораторіях на ВЕРХ/МС/МС. Так, у клініці університету Мюнхена щодня проводиться аналіз близько 70 зразків на вміст сиролімусу та циклоспорину А з використанням ВЕРХ/МС/МС системи. Вся підготовка зразків та керування приладом здійснюється одним співробітником. Лабораторія переключається також аналіз такролімусу цим методом.

Описано застосування ВЕРХ/МС/МС для одночасного рутинного визначення такролімусу, сиролімусу, аскоміцину, деметиксисиролімусу, циклоспорину А і циклоспорину G в крові. Діапазон обумовлених концентрацією 1.0 - 80.0 нг/мл. Для циклоспорину 25 - 2000 нг/мл. Протягом року у лабораторії було проаналізовано понад 50,000 зразків.
Оскільки було встановлено, що одночасне застосування такролімусу та сиролімусу дає позитивний терапевтичний ефект, було розроблено простий та ефективний ВЕРХ/МС/МС метод роздільного їх визначення у крові для клінічних аналізів. Аналіз одного зразка займає 2.5 хвилини з точністю від 2.46% - 7.04% для такролімусу і 5.22% - 8.30% для сиролімусу для всієї аналітичної кривої. Нижня межа визначення такролімусу 0.52 нг/мл, сиролімусу - 0.47 нг/мл.

V. Визначення гомоцистеїну методом ВЕРХ/МС/МС

Гомоцистеїн становить інтерес при серцево-судинних захворюваннях (тромбоемболії, хворобах серця, атеросклерозі) та інших клінічних станах (депресії, хвороби Альцхаймера, остеопорозі, ускладненнях при вагітності та ін.). Існуючі методи аналізу гомоцистеїну, включаючи імуноаналіз, є дорогими. Розроблено швидкий ВЕРХ/МС/МС метод аналізу гомоцистеїну для клінічного застосування рутинного при аналізі великої кількості зразків. Іонізація проводилася методом електророзпилення. Метод є відтворюваним, високоспецифічним та точним. Достоїнствами методу є також низька вартість реагентів та простота пробопідготовки. На добу можна проводити аналіз 500 і більше зразків.

Висновок

Слід зазначити, що навіть при тому, що в даний час використовуються значно вдосконалені методи імуноаналізу, в силу технічних принципових обмежень, даний метод ніколи не матиме порівнянну з ВЕРХ-МСМС точність і специфічність до цільової речовини, особливо в присутності метаболітів. Це не тільки призводить до низької точності методу ІФА та високого відсотка хибно-позитивних та хибно-негативних результатів, але й не дозволяє порівнювати результати, отримані у різних клінічних відділеннях при використанні методу ІФА. Застосування ВЕРХ-МС/МС усуває цей недолік, дозволяє проводити високоспецифічний, точний та швидкий аналіз великої кількості зразків з високою достовірністю у присутності метаболітів та відсутності перешкод від супутніх та ендогенних речовин, що перебувають у плазмі та крові пацієнтів.

Незважаючи на дорожнечу приладового комплексу, як показує світова практика, при правильній експлуатації, даний комплекс окупається за 1-2 роки. Це відбувається, перш за все, завдяки низькій собівартості одного аналізу за рахунок одночасного аналізу десятків і сотень сполук та відсутності необхідності придбання дорогих діагностичних наборів. Крім цього, у лабораторії з'являється можливість самостійно розробляти будь-які необхідні методики аналізу та не залежати від виробника наборів.

Вибір правильної конфігурації приладового комплексу

Існує велика кількість різних методів мас-спектрометрії та типів мас-спектрометрів, призначених для вирішення найрізноманітніших завдань – від структурної ідентифікації складних білкових макромолекул масою сотні тисяч Дальтон до рутинного високопродуктивного кількісного аналізу малих молекул.

Для успішного вирішення поставленої задачі однією з основних умов є вибір правильного типу обладнання. Немає універсального приладу, що дозволяє вирішувати весь спектр аналітичних завдань. Так, прилад, призначений для вирішення задачі ідентифікації мікроорганізмів, не здатний проводити кількісний аналізмалих молекул. І навпаки. Справа в тому, що, незважаючи на загальну назву, це абсолютно різні прилади, що працюють на різних фізичних принципах. У першому випадку це часпрогоновий мас-спектрометр з лазерним джерелом іонізації - MALDI-TOF, а в другому - потрійний квадруполь з іонізацією електроспреєм - ВЕРХ-МСМС.

Другим за значимістю параметром є вибір правильної конфігурації системи. Існує кілька основних виробників мас-спектрометричного обладнання. У приладів кожного виробника є не лише свої сильні, але й слабкі сторони, про які вони зазвичай вважають за краще мовчати. Кожен виробник випускає свою лінійку приладів. Вартість одного аналітичного комплексу знаходиться в інтервалі вартістю від 100 000 до 1 000 000 і більше доларів. Вибір оптимального виробника і правильної конфігурації устаткування дозволить як заощадити значні фінансові ресурси, а й ефективніше вирішувати поставлене завдання. На жаль, існує багато прикладів, коли обладнання лабораторії проводилося без урахування цих факторів. Результат - обладнання, що простоює, даремно витрачені гроші.

Третім чинником, визначальним успішну роботу лабораторії, є персонал. Для роботи на мас-спектрометрах потрібний висококваліфікований персонал. На жаль, в жодному ВНЗ Росії немає курсу сучасної практичної мас-спектрометрії, особливо стосовно клінічних додатків, і завдання навчання персоналу кожної лабораторії доводиться вирішувати самотужки. Звісно, 2-3 днів ознайомлювального тренінгу, проведеного виробником після запуску устаткування, цілком замало розуміння основ методу та придбання навичок роботи у приладі.

Четвертим чинником є готових методик аналізу. Кожна лабораторія має свої пріоритетні завдання, для вирішення яких необхідно розробляти свої методики. Робити це може людина, яка має досвід роботи на приладі не менше 2-3 років. Фірми-виробники іноді постачають одну-дві загальні методики рекомендаційного характеру, але адаптують їх під конкретні завдання лабораторії.

У ТОВ «БіоФармЕксперт»працюють фахівці з багаторічним стажем роботи на різних типах мас-спектрометрів, а також розроблення методик та постановка високопродуктивних аналізів. Тому ми надаємо такі послуги:

Вибір оптимальної конфігурації пристрою під конкретні завдання клієнта.
Закупівля, постачання та запуск обладнання провідних виробників тандемних мас-спектрометрів. Поетапне навчання персоналу протягом року з моменту запуску обладнання.
Набір готових методик та баз даних для вирішення основних клінічних завдань.
Розробка методик аналізу та вирішення конкретних завдань клієнта у його лабораторії із залученням його персоналу.
Методична підтримка всіх стадіях роботи.

Протягом багатьох років скринінг в основному виконували тестами, специфічними для кожного окремого захворювання Наприклад, скринінг ФКУ був заснований на мікробіологічній чи хімічній оцінці підвищення фенілаланіну.

Ця ситуація повністю змінилася за останнє десятиліттяіз появою технології тандемної мас-спектрометрії (ТМС). Аналіз тандемної мас-спектрометрією (ТМС) може не тільки точно і швидко виявити підвищений фенілаланін у плямі крові у новонародженого з меншою кількістю хибно-позитивних відповідей порівняно зі старими методами, але також одночасно дозволяє виявити кілька десятків інших біохімічних порушень.

Деякі з них вже скринували індивідуальними тестами. Наприклад, багато держав використовували специфічні тести для виявлення підвищення метіоніну, щоб виявляти Тандемний мас-спектрометрія (ТМС) виявилася також надійним методом неонатального скринінгу деяких захворювань, що відповідають критеріям скринінгу, але не мали раніше надійного тесту.

Наприклад, недостатність MCAD- Захворювання окислення жирних кислот, зазвичай безсимптомне, але виявляється клінічно, коли у пацієнта підвищується катаболізм. Виявлення недостатності MCAD при народженні може виявитися життєво важливим, оскільки хворі діти мають дуже високий ризик життєзагрозливої гіпоглікемії в ранньому дитинстві при катаболічних станах, спричинених інтеркурентними захворюваннями, наприклад вірусною інфекцією.

Майже чверть дітей з недіагностованою недостатністю MCADвмирають при першому ж епізоді. При правильному лікуванні метаболічний розлад може бути усунутий. При недостатності MCAD первинна мета скринінгу - попередження батьків та лікарів про ризик метаболічної декомпенсації, тому що діти між нападами практично здорові і не потребують щоденного лікування, крім виключення тривалого голодування.

Проте використання тандемної мас-спектрометрії(ТМС) для неонатального скринінгу залишається під сумнівом. Крім забезпечення швидкого тестування багатьох порушень, неонатальний скринінг при яких вже робиться або може бути виправданий, тандемна мас-спектрометрія (ТМС) також виявляє новонароджених з вродженими помилками метаболізму типу метилмалонової ацидемії, які зазвичай не входять до програм скринінгу через їхню рідкість і труднощі. остаточною терапією, що оберігає від прогресуючого неврологічного погіршення.

Захворювання, що виявляються при тандемній мас-спектрометрії

I. Аміноацидемії:
- ФКУ
- Хвороба сечі із запахом кленового сиропу
- Гомоцистінурія
- Цитрулінемія
- Аргінінобурштинова ацидурія
- тирозинемія I типу

ІІ. Органічні ацидемії:
- Пропіонова ацидемія
- Метилмалонова ацидемія
- Ізовалеріанова ацидемія
- Ізольована 3-метил-кротоніл-гліцинемія
- глутарова ацидемія (тип I)
- Недостатність мітохондріальної ацетоацетил-коА-тіолази
- Гідроксиметилглутарова ацидемія
- Недостатність множини коА-карбоксилаз

ІІІ. Порушення окислення жирних кислот:
- Недостатність SCAD
- Недостатність гідрокси-SCAD
- Недостатність MCAD
- Недостатність VLCAD
- Недостатність LCAD та недостатність трифункціонального білка
- глутарова ацидемія II типу
- Недостатність карнітин-пальмітоїлтрансферази II

Тандемна мас-спектрометрія (ТМС)може також ідентифікувати аномальні метаболіти з невизначеним значенням для здоров'я. Наприклад, недостатність SCAD – інше захворювання окислення жирних кислот, найчастіше безсимптомне, хоча деякі пацієнти можуть мати труднощі, пов'язані з епізодичною гіпоглікемією. Таким чином, прогностична цінність позитивного результату аналізу тандемної мас-спектрометрії для симптоматичної SCAD, ймовірно, буде дуже низькою.

Чи переважує перевага виявлення недостатності SCADнегативний вплив тесту, що викликає невиправдане занепокоєння батьків, для більшості новонароджених з позитивним результатом тесту, які так ніколи і не проявили клінічних симптомів? Таким чином, не кожне захворювання, яке виявляється методом тандемної мас-спектрометрії (ТМС), відповідає критеріям для неонатального скринінгу.

Саме тому деякі експертиу системі охорони здоров'я доводять, що батькам та лікарям потрібно повідомляти лише про відхилення у метаболітах з доведеною клінічною користю. Інші відстоюють використання всієї інформації, що надається тандемною мас-спектрометрією (ТМС), і пропонують повідомляти батькам та лікарям про всі аномальні метаболіти, незалежно від того, наскільки добре захворювання відповідає стандартним критеріям неонатального скринінгу. Надалі можна ретельно спостерігати пацієнтів з аномаліями невідомого значення. З усіх цих причин використання тандемної мас-спектрометрії (ТМС) для скринінгу новонароджених залишається предметом дискусії.

Для популяційного скринінгуу допологовому періоді зазвичай використовують два тести: хромосомний аналіз у жінок старшого віку та АФП сироватки крові матері або потрійний тест на ДНТ та хромосомні анеуплоїдії.

Якщо вагітністьнаражається на ризик через інвазивну процедуру пренатальної діагностики хромосомної анеуплоїдії внаслідок віку матері, також слід запропонувати додаткове обстеження, наприклад визначення рівня АФП в амніотичній рідині, повногеномну порівняльну гібридизацію для пошуку небезпечних субмікроскопічних делецій та скринінгмута.

Що таке Тандемна Мас-спектрометрія

Тандемна мас-спектрометрія (ТМС) - один із сучасних методів аналізу сполук, який широко використовується для різних як наукових, так і практичних цілей. Цей метод дозволяє проводити аналіз кількох сотень сполук у мікрокількості біологічного матеріалу.

Де застосовується цей метод?

У світовій практиці охорони здоров'я цей метод застосовують щодо масового скринінгу новонароджених на спадкові хвороби обміну речовин (НБО). У плямі висушеної крові можливе визначення амінокислот (у тому числі і фенілаланіну) та ацилкарнітинів. Кількісне визначення цих речовин дозволяє виключати кілька десятків спадкових захворювань, що належать до різних класів НБО (порушення метаболізму амінокислот, органічних кислот та дефектів мітохондріального β-окислення жирних кислот). За закордонними літературними даними їх сумарна частота становить 1:2000 живих новонароджених. Раніше для діагностики цих порушень була потрібна велика кількість біологічного матеріалу, проведення кількох досліджень (амінокислотний аналіз, хроматомас-спектрометрія, визначення спектру ацилкарнітинів), що вимагало значного часу та матеріальних витрат. ТМС дозволяє кількісно визначити всі ці сполуки протягом одного аналізу!

Які захворювання можна виявити за допомогою цього?

На жаль, одного універсального високочутливого та специфічного тесту для діагностики всіх відомих НБО поки не існує, але технології, спрямовані на виявлення кілька десятків і навіть сотень хвороб в одному аналізі вже стають реальністю. До таких методів і ТМС. Цей метод дозволяє з високою достовірністю виявляти близько 40 спадкових порушень метаболізму амінокислот, органічних кислот та дефектів бета-окислення мітохондріального жирних кислот. Більшість із цих захворювань проявляються в період новонародженості. Перелік захворювань, які можна діагностувати із застосуванням цієї технології, наведено в розділі аналізи

Чому необхідно якомога раніше діагностувати хвороби обміну речовин?

Багато лікарів помилково вважають, що НБО зустрічаються так рідко, що виключати їх потрібно лише в останню чергу, і дуже часто правильний діагноз встановлюється вже на пізніх термінах чи захворювання взагалі не діагностується.

Проте, вже відомо більше 150 форм НБО для яких розроблено методи ефективної терапії і від того, як швидко і правильно поставлений діагноз багато в чому залежить життя та здоров'я пацієнта. Для 20 захворювань, які можна діагностувати із застосуванням ТМС, розроблено спеціальне лікування. Поставлений вчасно діагноз - врятоване життя та здоров'я пацієнта!

Правила збирання зразків крові

Кров збирається на стандартну картку-фільтр (№903), яку застосовують для скринінгу новонароджених на ФКУ. Кров може бути як капілярна (з пальця, п'яти), і венозна. Необхідно добре просочити виділену область на фільтрі! На картці-фільтрі обов'язково має бути чітко вказано ПІБ, ким і звідки направлений пацієнт, дата народження та телефон лікаря. Зразок висушується 2-3 години на повітрі. Бажано докласти витяг з історії хвороби.