Головна Симптоми Як проводиться пцр діагностика Аналізи методом пцр. Висока чутливість дослідження

Як проводиться пцр діагностика Аналізи методом пцр. Висока чутливість дослідження

ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) - досягнення молекулярної біології, одна з основних методик клінічної лабораторної діагностики кінця 20-го і початку 21-го століть, що приносить велику користь у різних галузях медичної науки.

Таким чином, навіть якщо серед мільйонів клітин людського організму загубиться не сам живий вірус, а лише частка його ДНК, то ПЛР, якщо їй ніщо не завадить, мабуть, упорається із завданням та повідомить про перебування «чужинця» позитивним результатом. У цьому суть ПЛР та її основна перевага.

Гідності й недоліки

До лабораторії, що здійснює ПЛР-діагностику, пред'являються високі вимоги щодо обладнання, тест-систем і кваліфікації медичного персоналу. Це високотехнологічна лабораторія, що має в своєму розпорядженні арсенал високочутливих і високоспецифічних реагентів, тому особливих недоліків вона не має. Хіба що видає позитивний результат за відсутності клінічних проявів і тим самим ставить лікаря перед дилемою: чи варто розпочинати лікування чи ні?

Лікар, який спостерігає пацієнта, починає сумніватися у достовірності результатів тестування, оскільки жодних ознак захворювання не бачить. Але все ж таки, враховуючи високу чутливість ПЛР-системи, слід пам'ятати, що вона виявляє збудника навіть у доклінічній стадії, а позитивний результат у такому разі є скоріше гідністю, ніж недоліком. Виходячи з цього, лікар повинен сам прийняти рішення про доцільність терапії, взявши до уваги й інші аргументи «за» і «проти».

Переваги діагностики за допомогою полімеразної ланцюгової реакції очевидні:

Висока специфічність, що досягає 100%, обумовлена присутністю у відібраному зразку частинок нуклеїнових кислот, властивих конкретному організму, але чужорідних людині;
Висока продуктивність, адже ПЛР – високотехнологічна автоматизована методика, що надає можливість проведення тестування в день забору матеріалу та рятування, таким чином, пацієнта від зайвих тривожень;
ПЛР, працюючи над однією пробою, здатна провести кілька досліджень і про виявити кілька збудниківякщо їй буде таке завдання. Наприклад, при діагностиці хламідійної інфекції, де ПЛР відноситься до основних методів, поряд з хламідій, можна виявити і Нейссер (гонокок) - збудник. Причому на достовірності результатів це негативно не відбивається;
Тестування методом ПЛР ви виявляє небезпечні мікроорганізми в інкубаційному періодіКоли вони ще не встигли завдати відчутної шкоди організму, тобто рання діагностика попереджає про майбутній розвиток патологічного процесу, що дає можливість підготуватися до нього і прийняти у всеозброєнні.

Крім цього, щоб уникнути непорозумінь, що іноді виникають при діагностиці, ПЛР захищає себе ще й тим, що її результати можуть зафіксуватися (фотографія, комп'ютер) з метою використання їх в експертних цілях, якщо буде на те необхідність.

Нормою у відповідях ПЛР вважають негативний результат, що вказує на відсутність фрагментів чужорідних нуклеїнових кислот, позитивна відповідь свідчить про наявність інфекції в організмі, цифрові значення означають стан вірусу та його концентрацію на момент тестування. Проте повне розшифрування аналізу здійснює лікар, який пройшов спеціальне навчання на тему «ПЛР». Намагатися ж інтерпретувати результати самостійно немає сенсу, оскільки можна, що швидше за все й станеться, неправильно зрозуміти і почати завчасно хвилюватися.

Чого боїться ПЛР, що вона вміє і як до неї підготуватися?

Як у будь-яких інших дослідженнях, іноді результати тесту виявляються хибнопозитивними або хибнонегативними, де ПЛР винятком не є. Подібне може відбуватися у випадках:

Порушення технологічного процесу одному з етапів реакції;
Недотримання правил забору матеріалу, його зберігання чи транспортування;
Присутність сторонніх домішок у матеріалі.

Це говорить про те, що до ПЛР - діагностики інфекцій потрібно підходити уважно, обережно і акуратно, інакше зразки матеріалу можуть поміняти свою структурну будову або зовсім зруйнуватися.

Етапи ПЛР-діагностики. Помилкові результати можуть дати порушення будь-якому з етапів дослідження.

ПЛР-діагностика інфекцій відноситься до категорії «золотих стандартів» серед інших лабораторних методів, тому її можна застосувати для пошуку збудників багатьох захворювань, які на перший погляд не мають нічого спільного між собою:

Туберкульоз різної локалізації, пневмонія (у тому числі і атипова, спричинена хламідія);
Дитячі інфекції (корова краснуха, паротит, кір);
Дифтерія;
Сальмонельоз;
Зоонозна інфекційна хвороба – листериоз (захворювання характеризується різноманіттям симптомів із ураженням лімфовузлів, ЦНС, внутрішніх органів);
Захворювання, зумовлені проникненням вірусу Епштейн-Барра (інфекційний мононуклеоз та ін.);
Онкологічна патологія, спровокована папіломовірусною інфекцією (ВПЛ та його типи);
Бореліоз (хвороба Лайма, кліщовий енцефаліт);
Хелікобактерна інфекція, збудником якої є мікроб Helicobacter pylori, що проживає в шлунку людини. Доведено, що хелікобактер стає причиною розвитку раку шлунка або 12-палої кишки;
і практично все.

ПЛР-діагностика інфекцій, що передаються статевим шляхом, має особливе значення, оскільки захворювання, викликані таким чином, часто тривалий час протікають без будь-яких клінічних проявів, зате при вагітності починають активізуватися і, таким чином, загрожувати здоров'ю і навіть життю дитини. Аналогічно поводяться і . Деякі з них («торч») ставляться одночасно і до ІПСШ, тому останні вимагають докладнішого розгляду. Ознайомитись із найпопулярнішими методиками читач зможе у наступних розділах статті.

Як правильно підготуватись, щоб отримати достовірний результат?

Відразу зауважимо, що підготовка до ПЛР досить проста, ніяких особливих зусиль пацієнта не вимагає. Потрібно лише виконати три нескладні завдання:

Не мати статевих контактів за 24 години перед тим, як здати аналіз;
Для забору та аналізу крові з вени потрібно прийти на голодний шлунок, пити, до речі, теж не можна;
Здати сечу слід нічну (вранці – у стерильну баночку, придбану напередодні в аптеці).

ПЛР може працювати в будь-якому біологічному середовищі

Метод ПЛР не відрізняється «кровожадністю», тому приймає будь-яке біологічне середовище, що містить передбачуваний інфекційний агент. вибір – що потрібно взяти на дослідження, залишається за лікарем.

Таким чином, у пошуках збудника, крім аналізу крові (хоча він теж підходить і в більшості випадків береться паралельно до іншого матеріалу), можна використовувати:

(Виділення урогенітального тракту);
Зішкріб слизових ротової порожнини, кон'юнктиви, носоглотки, статевих шляхів (у жінок беруть із шийки матки та піхви, у чоловіків – з уретри);
Слину;
Сперму;
сік передміхурової залози;
Тканини плаценти та амніотіотичну рідину (навколоплодні води);
Осад сечі (після центрифугування), наприклад, для виявлення деяких ІПСШ та мікобактерій туберкульозу;
Мокроту та плевральну рідину з тією ж метою;
ексудати;
Спинномозкову рідину при підозрі на інфекційну поразку ЦНС;
Біопсійний матеріал (біоптат), взятий з печінки, 12-палої кишки, шлунка та ін.

До вищепереліченого хочеться додати, що матеріалу для тестування у всіх випадках, навіть у зіскрібках та виділеннях, буде достатньо, оскільки тестування методом ПЛР великих обсягів не вимагає, аналізу вистачає і кількох мікролітрів, які зазвичай беруть у мікропробірку типу «епендорф» і відправляють на Вивчення.

Хвороби та застосування ПЛР

ВІЛ та полімеразна ланцюгова реакція

Зазвичай при проходженні анонімного обстеження у разі позитивних результатів імуноблотингу діагностику повторюють заново. Якщо діагноз підтверджується, пацієнту призначають додаткові дослідження:

Визначення за допомогою імунологічних реакцій абсолютних значень кількості лімфоцитів CD 4 (імунокомпетентні клітини – Т-хелпери або помічники), які інфекція вражає насамперед, після чого вони втрачають свої основні властивості та не можуть відрізнити «своє» та чуже». РНК вірусу, що циркулює в плазмі крові, вони приймають за нормальні клітини організму і не реагують на них;
Виявлення РНК вірусу методом ПЛР та розрахунок концентрації вірусних частинок з метою встановлення стадії, тяжкості патологічного процесу та прогнозу з урахуванням цих даних. Зрозуміло, слово «норма» у плані немає, оскільки реакція завжди позитивна, а розшифровка цифрових значень перебуває у компетенції лікаря.

ПЛР та гепатити

Методом ПЛР можна виявляти збудників, найчастіше тест використовується для діагностики гепатиту, який погано визначається іншими методами.

Вірус гепатиту С (РНК містить) за своєю поведінкою в організмі людини нагадує ВІЛ. Вклинюючись у геном клітин печінки (гепатоцитів), він перебуває там в очікуванні свого часу, який може наступити хоч через 2 роки, хоч через 20 років, тому медики прозвали його «лагідним вбивцею». Гепатит С призводить до формування злоякісного процесу у печінковій паренхімі, що проявляється на пізніх стадіях. Всі ці події імунна система не помічає, беручи вірус за гепатоцит. Щоправда, антитіла до вірусу у деяких кількостях виробляються, проте вони не забезпечують гідну імунну відповідь. Для діагностики ІФА на гепатит С не дуже інформативний, оскільки вказує на те, що вірус залишив сліди, а чи пішов сам – невідомо. При ВГС відомі випадки самовилікування, тоді як антитіла проти вірусу залишаються і продовжують циркулювати довічно (імунологічна пам'ять). ПЛР помітно випереджає утворення антитіл і може виявити вірусну частинку вже через 1-1,5 тижнів, тоді як АТ можуть з'явитися в інтервалі від 2 місяців до півроку.

ПЛР-діагностика у разі підозри на розгул вірусу гепатиту С в організмі людини є найбільш оптимальним методом дослідження, бо тільки вона здатна розпізнати присутність «лагідного ворога» у крові або біоптаті печінки пацієнта.

Однак іноді мають місце випадки, коли АТ позитивні, а результат ПЛР – негативний. Таке іноді відбувається при дуже низькій кількості вірусу або при його "дрімління" стані в печінці без виходу в кров'яне русло. Щоб таки знайти істину, у пацієнта беруть повторний аналіз, а то й не один.

Папіломовірусна інфекція

Якщо не станеться самовилікування, теж може, нічим себе не виявляючи, довго персистувати в організмі господаря, який про це навіть не підозрює, оскільки ПЛР зробити не доводилося, а симптоми хвороби були відсутні. Однак наявність папіломовірусної інфекції, нехай і латентної, далеко не байдужа для здоров'я людини, де особливу небезпеку несуть певні типи вірусу, що спричиняють онкологічні захворювання (типи 16, 18).

Найчастіше від ВПЛ страждає жіноча половина населення, оскільки вірус більше любить жіночу статеву сферу, а особливо – шийку матки, де деякі типи вірусів сприяють розвитку диспластичних процесів, а потім і раку шийки матки, якщо не лікувати дисплазію та дати волю вірусу. Так ось, полімеразна ланцюгова реакція виявить вірусну ДНК, а потім вкаже "поганий" або "хороший" (онкогенний або неонкогенний) тип оселився в організмі жінки.

Інші ІПСШ та TORCH-інфекції

Очевидно, що полімеразна ланцюгова реакція може знайти будь-яку чужорідну структуру, що складається з нуклеїнових кислот, тому даний тест підходить для виявлення всіх ЗПСШ та TORCH-інфекцій, проте він далеко не завжди використовується. Навіщо, скажімо, проводити такі дорогі дослідження для виявлення чи гонокока, якщо є доступніші та дешевші?

TORCH-інфекції та ІПСШ настільки взаємопов'язані, що часом важко визначити, до якої групи слід віднести той чи інший збудник. У них взагалі буває складно розібратися, так як це досить різноманітні групи мікроорганізмів, які можуть передаватися статевим шляхом завжди або тільки за певних умов (імунодефіцит), а можуть становити інтерес лише за вагітності, зважаючи на можливий негативний вплив на її перебіг і на плід.

ПЛР – головний метод виявлення прихованих інфекцій

В основі розвитку клінічних проявів лежать різні збудники, знайти які буває під силу тільки ПЛР, що є її основним завданням іноді спільно з ІФА, а іноді як єдиний підтверджуючий тест, особливо, якщо симптоматика захворювання відсутня.Таку непросту ситуацію може створювати полімікробна інфекція, яка крім явних збудників включає ще й умовно-патогенні.

Уреаплазма найчастіше розглядається у парі з мікоплазмою.І це недарма. Дані види, як і хламідії, не відносять ні до вірусів, ні до бактерій, вони проживають усередині клітин і відносяться до ІПСШ, хоча їхня присутність у здоровому організмі теж далеко не рідкість. Так от, щоб відрізнити здорового носія від хворої людини, потрібні особливі методи, де ПЛР вважається найбільш надійним, оскільки, зважаючи на особливості будови та поведінки цих мікроорганізмів, інші дослідження виявляються неефективними.

Що стосується (тип 1, 2) і , який теж відноситься до герпесвірус (тип 5), то тут теж ситуація неоднозначна. Інфікованість населення земної кулі наближається до 100%, тому в даному випадку дуже важлива ідентифікація вірусу та його доза, що особливо відіграє роль при вагітності, адже дорослій людині вірус, що прижився в його організмі, часто не завдає жодного клопоту та ознак захворювання не дає.

Тому не слід ігнорувати призначене лікарем подібне обстеження, адже в деяких випадках полімеразна ланцюгова реакція є обов'язковим і необхідним методом лабораторної діагностики, здатним захистити від серйозних ускладнень не тільки жінку, а й маленьку людину, яка ще не народилася.

Насамкінець хочеться відзначити, що такий чудовий метод, як ПЛР, ось уже понад 30 років служить людству. При цьому завдання тесту не обмежуються пошуком збудників інфекційних захворювань. Полімеразна ланцюгова реакція, народжена на ґрунті молекулярної біології, нерозривно пов'язана з генетикою, вона успішно застосовується у криміналістиці для ідентифікації особистості, у судовій медицині для встановлення батьківства, у ветеринарії, якщо клініка для тварин має змогу купувати дороге обладнання, а також в інших сферах (промисловість, сільське господарство та ін.).

Відео: ПЛР - суть та застосування

Генетика бактерій Інформація для другого заняття.

Полімеразна ланцюгова реакція

Полімеразна ланцюгова реакція - метод, що дозволяє провести багаторазове збільшення (ампліфікацію) кількості певних молекул ДНК в зразку, що аналізується (у тому числі в біологічному матеріалі або чистій культурі).

Головні переваги ПЛР як діагностичного методу в мікробіології - дуже висока чутливість, що дозволяє виявлення вкрай малих концентрацій збудників у зразках, а також регульована специфічність, що дозволяє виявляти або ідентифікувати збудників на родовому, видовому або субвидовому рівні. Основний недолік ПЛР випливає з його вкрай високої чутливості - образи дуже легко забруднити ДНК з позитивного контролю, іншого зразка або продукту ПЛР, що призведе до хибно-позитивної реакції. Це накладає жорсткі обмеження на умови, в яких проводиться змішування ПЛР та робота з готовими продуктами ПЛР.

Проведення ПЛР.Готується реакційна суміш, що містить такі компоненти:

Виділену ДНК з досліджуваного зразка,

Буферний розчин

Іони Mg2+ (необхідні для роботи ферменту),

Два праймери - одноланцюгові короткі молекули ДНК (довжина найчастіше від 18 до 24 нуклеотидів), комплементарні кінцям різних ланцюгів послідовності ДНК, що виявляється.

Суміш дезоксинуклеотидтрифосфатів.

Термостійку ДНК-полімеразу (найчастіше використовується Taq-полімераза - полімераза, виділена з Thermus aquaticus).

Потім дана реакційна суміш міститься в ампліфікатор, який фактично є програмованим термостатом. В ампліфікаторі проводиться 30-40 циклів зміни температури. Кожен із цих циклів складається з трьох етапів (див. рис. 1):

Денатурація (температура 94 про З) – розриваються водневі ланцюги, і ланцюжка ДНК розходяться.

Відпал праймерів (температура зазвичай близько 50-60 про З) – до кінців ланцюгів ДНК приєднуються праймери. Взагалі, при зниженні температури енергетично вигідніше возз'єднання вихідних ланцюгів ДНК з досліджуваного зразка (ренатурація), проте концентрація праймерів в реакційній суміші на багато порядків більше концентрації ДНК зі зразка (принаймні, на початкових циклах ПЛР), тому реакція відпалу праймерів протікає швидше ДНК. Температура відпалу вибирається залежно від температури плавлення (денатурації) праймерів.

Елонгація (температура зазвичай 72 про С) – ДНК-полімераза добудовує праймери матриці довгих ланцюгів ДНК. Температура відповідає оптимальній температурі роботи використовуваної ДНК-полімерази.

Детекція результатів відрізняється у різних варіантах постановки ПЛР та описана у розділі «Різновиди ПЛР».

Динаміка ПЛР

На ранніх циклах ПЛР кількість дволанцюгових молекул ДНК, розмір яких визначається відстанню між місцями посадки праймерів, подвоюється з кожним циклом. Також утворюється мала кількість довших молекул ДНК, яких можна знехтувати (див. рис 2).

Таким чином, на ранніх циклах кількість продукту ПЛР описується формулою m*2 n , де m – вихідна кількість шуканої ДНК у пробі, n – число циклів. Потім реакція виходить на плато. Це відбувається через накопичення продукту реакції, зниження концентрації праймерів і дезоксинуклеотидтрифосфатів, а також підвищення концентрації пірофосфату (див. Рис 3).

Різновиди ПЛР

Конвенційна ПЛР

У даному варіанті постановки ПЛР реакція йде заздалегідь обране число циклів (30-40), після чого аналізується, чи накопичення дволанцюгових молекул ДНК відбулося в реакційній суміші.

Даний варіант постановки ПЛР при використанні як спосіб діагностики є якісним методом. Позитивна реакція свідчить про наявність хоча б слідових кількостей молекул ДНК, що шукаються в зразку. Негативна реакція свідчить про їхню відсутність. Кількісна оцінка вмісту вихідних молекул ДНК у зразку неможлива через вихід реакції на плато.

Основним методом виявлення наявності продукту є електрофорез у агарозному або поліакриламідному гелі. Продукти ПЛР поділяються в гелі під дією електричного поля відповідно до їх молекулярної маси. У гель додається інтеркалюючий барвник (флуоресцентний у пов'язаному з дволанцюжковою ДНК стані - найчастіше бромистий етидій). Таким чином, при опроміненні ультрафіолетом можна буде побачити наявність або відсутність смужки, що відповідає ДНК необхідної молекулярної маси. Під час проведення ПЛР у діагностичних цілях завжди ставляться позитивний і негативний контролі реакції, із якими порівнюються зразки (див. рис. 4).

ПЛР у реальному часі

У даному варіанті постановки ПЛР кількість продукту ПЛР реакційної суміші реєструється постійно в ході протікання реакції. Це дозволяє побудувати криву перебігу реакції (див. рис. 3) і, виходячи з неї, розрахувати кількість шуканих молекул ДНК у зразках.

Один із видів проведення ПЛР у реальному часі – з використанням інтеркалюючого барвника, який додається прямо в реакційну суміш (найчастіше використовується SYBRGreen). Інший вид - з використанням одного з видів флуоресціюючих зондів, що зв'язуються з ділянкою всередині ПЛР-продукту, що дозволяє підвищити специфічність виявлення (див. Рис 5). Детекція флуоресценції відбувається безпосередньо в приладі в ході протікання реакції.

Крім можливості кількісного виявлення, існують інші переваги ПЛР в реальному часі в порівнянні з конвенційною. Даний варіант ПЛР більш простий, швидкий, а також не вимагає відкриття пробірок з продуктами ПЛР, що зменшує ймовірність забруднення інших зразків. Основний недолік – більш висока вартість ампліфікатора із вбудованою можливістю детекції флуоресценції порівняно із звичайним.

Цифрова кількісна ПЛР

Новий, дорогий і поки що малопоширений варіант ПЛР, що дозволяє більш точно визначати кількість ДНК у зразку. У даному варіанті реакційна суміш, що містить флуоресцентний барвник, розбивається на величезну кількість мікроскопічних об'ємів (наприклад, крапельок в емульсії). Після протікання ПЛР аналізується, у якій частці крапель реакція виявилася позитивною і, відповідно, спостерігається флуоресценція. Ця частка буде пропорційна числу шуканих молекул ДНК у зразку.

ПЛР із зворотною транскрипцією

У разі перед тим чи іншим варіантом ПЛР виробляється реакція зворотної транскрипції (РНК в ДНК) з допомогою ферменту ревертази. Таким чином, цей метод дозволяє проводити якісне чи кількісне виявлення молекул РНК. Це може використовуватися для детекції РНК-вірусів або визначення рівня транскрипції (кількості мРНК) того чи іншого гена.

Малюнок 1.Етапи ПЛР. Червоним кольором позначені праймери.

Малюнок 2.Накопичення дволанцюгових молекул ДНК, обмежених праймерами, під час ПЛР.

Малюнок 3.Динаміка реакції ПЛР при різних початкових концентраціях молекул ДНК, що шукаються в пробі. (а) – найбільша концентрація (б) – проміжна концентрація (в) – найменша концентрація

Малюнок 4.Агарозний електрофорез продуктів ПЛР. К+ - позитивний контроль (заздалегідь присутня ДНК, що шукається). 1-7 - досліджувані зразки (з них 1-2 - позитивні, 3-7 - негативні). K-негативний контроль (відомо відсутня шукана ДНК). У багатьох випадках, крім цільового продукту, видно більш легкі неспецифічні продукти реакції (праймер-димери).

Малюнок 5.Способи детекції під час використання ПЛР у часі. (а) – інтеркалюючий барвник – флуоресціює при зв'язуванні з дволанцюжковою ДНК (б) – зонд Taqman – флуоресценція виникає при розщепленні зонда ДНК полімеразою з 5'-3' ендонуклеазною активністю за рахунок поділу флуорофору та гасника. (в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценція виникає при гібридизації зонда з цільовим фрагментом за рахунок просторового віддалення флуорофору та гасника (г) – зонди LightCycler - флуоресценція акцептора виникає при гібридизації зондів перенесення (FRET).

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR – polymerase chain reaction) – метод отримання безлічі копій певних фрагментів ДНК (генів) у біологічному зразку.

Сутність ПЛР як методу молекулярної біології полягає у багаторазовому вибірковому копіюванні певного гена (дільниці ДНК) за допомогою спеціальних ферментів в умовах in vitro. Важливою особливістю ПЛР є отримання копій конкретної ділянки ДНК (гену), що відповідає заданим умовам. Синонімом процесу копіювання ДНК є "ампліфікація". Реплікація ДНК in vivoтакож може вважатися ампліфікацією. Однак, на відміну від реплікації, у процесі полімеразної ланцюгової реакції ампліфікуються короткі ділянки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидів).

Основні принципи

Отже, ПЛР - це багаторазове копіювання певних фрагментів ДНК in vitro в процесі температурних циклів, що повторюються. Як же відбувається процес реакції в межах одного температурного циклу?

Утворення нуклеотидного ланцюга здійснюється ферментом ДНК-полімеразою. Однак для початку роботи ферменту необхідний стартовий майданчик. Як майданчики виступають "праймери" (затравки) - синтетичні олігонуклеотиди довжиною 15-20 нуклеотидів. Праймерів має бути два (прямий і зворотний), вони комплементарні ділянкам ДНК-матриці і саме фрагмент ДНК, обмежений праймерами, багаторазово копіюватиметься ДНК-полімеразою. Робота полімерази полягає в послідовному додаванні нуклеотидів, комплементарних послідовності ДНК-матриці. Тим самим в одному температурному циклі знову синтезується два нових фрагменти ДНК (т.к. молекула ДНК - дволанцюжкова, то і матриць спочатку дві). Таким чином, за 25-35 циклів у пробірці накопичуються мільярди копій ділянки ДНК, визначеної праймерами. Структуру окремого циклу можна представити так:

денатурація ДНК (плавлення, розбіжність ланцюгів ДНК) – 95°С – 1 або 2 хвилини;
відпал праймерів (затравки зв'язуються з ДНК-матрицею, температура цієї стадії визначається нуклеотидним складом праймера) - 60 ° С (наприклад) - 1 хвилина;
елонгація ДНК (полімераза синтезує ланцюг ДНК) - 72°С - 1 хвилина (час залежить від довжини фрагмента, що синтезується).

Приладова база для застосування методу полімеразної ланцюгової реакції в лабораторії повинна складатися з:

(або, як його ще називають термоциклера);
системи для с (для візуалізації результатів ПЛР);
системи (для аналізу результатів ПЛР);
(Для пробопідготовки);
набору (механічних чи електронних).

Крім основного та допоміжного обладнання для повноцінного функціонування ПЛР-лабораторії необхідні деякі витратні матеріали: стерильні наконечники, пробірки, штативи для пробірок і дозаторів.

Реагентна база в звичайній ПЛР-лабораторії для проведення повноцінної полімеразної ланцюгової реакції включає фермент ДНК-полімеразу з буфером, праймери (невеликі синтетичні фрагменти ДНК, комплементарні початку і кінці аналізованої ділянки ДНК-матриці), суміш нуклеотидів (А, Т, Г, Ц). Також абсолютно потрібна очищена вода.

Переваги методу ПЛР

Висока чутливість дослідження

Чутливість методу така, що ампліфікувати ПЛР і виявити цільову послідовність можна навіть у тому випадку, якщо вона зустрічається одного разу в зразку з 5 клітин.

Специфіка аналізу

ПЛР дозволяє виявляти ДНК конкретного інфекційного агента у присутності ДНК інших мікроорганізмів та ДНК організму-господаря, а також проводити генотипування. Специфічно підбираючи компоненти реакції (праймери), Ви можете одночасно виявляти ДНК близьких мікроорганізмів.

Універсальність методу ПЛР

Справа в тому, що для ПЛР-діагностики інфекційних захворювань, або спадкових захворювань людини можна використовувати те саме обладнання, слідувати універсальним процедурам підготовки зразків (проб) і постановки аналізу, а також однотипні набори реактивів.

Економія часу

Важлива перевага ПЛР – відсутність стадій культуральної мікробіологічної роботи. Підготовка зразків, проведення реакції та аналіз результатів максимально полегшений та багато в чому автоматизований. Завдяки цьому час отримання результату може скорочуватися до 4-5 годин.

Ефективність методу ПЛР

Широта досліджуваного клінічного матеріалу

Як зразок при полімеразній ланцюговій реакції може бути використаний не тільки біологічний матеріал від хворого, але також і багато інших субстратів, в яких можуть бути ідентифіковані молекули ДНК з високою чутливістю, наприклад, вода, грунт, продукти харчування, мікроорганізми, змив та багато іншого .

Всі перелічені вище переваги цього унікального методу - висока чутливість і специфічність, ідентифікація інфекційного агента та проведення генотипування будь-якого гена людини, висока ефективність та економія часу, універсальність приладової бази - дозволяють широко застосовувати сьогодні метод ПЛР у клінічній діагностиці, медичній практиці, наукових дослідженнях якості та багатьох інших областях.

Застосування ПЛР

Області застосування полімеразної ланцюгової реакції як сучасного методу молекулярної біології різноманітні. Багато в чому це обумовлено широтою матеріалу, який можна аналізувати (практично все, з чого можна виділити більш-менш якісну ДНК може стати об'єктом дослідження), а також підібраних праймерів. Основні сфери застосування ПЛР:

клінічна медицина

екологія

моніторинг стану довкілля
аналіз продуктів харчування
аналіз генетично-модифікованих організмів (ГМО)

судова медицина та криміналістика

ідентифікація особи
встановлення батьківства

фармакологія

ветеринарія

наукові дослідження (молекулярна біологія, генетика)

Організація лабораторії ПЛР

Інформація для замовлення

Найменування	Об `єм	Виробництво	Метод	Кат.Номер

ПЛР - діагностика інфекцій, сучасний та високоточний спосіб виявлення різних інфекційних захворювань. Чим він відрізняється від інших аналізів?

Розшифровується ця абревіатура як полімеразна ланцюгова реакція. Її, як свідчить Вікіпедія, винайшов у 1983 році Кері Мюлліс, американський вчений. За відкриття він отримав Нобелівську премію.

Певний час ПЛР використовували лише з науковою метою, після її успішно запозичила медицина. Суть дослідження полягає у розпізнаванні збудника інфекції на рівні ДНК та РНК. Кожен збудник, проникаючи в ДНК, змінює його структуру за певним типом. Саме з вигляду зміненої ДНК лаборанту стає зрозуміло, яке захворювання ховається в людини. Серед інших переваг ПЛР:

Особливості методу ПЛР:

Точність (помилки мінімальні та частота їх не перевищує 0,01%);
Чутливість (тест «обчислює» поодинокі бактерії у крові та мазках);
Специфічність (ПЛР виявляє інфекції, які часто зовсім не проявляють себе до важкої стадії);
Унікальність (аналізи результативні у ситуаціях, коли інші дослідження нічого не виявляють).

Результати аналізу ПЛР

Як працює метод ланцюгової реакції, як підготуватися до аналізу?

Ланцюгова реакція в лабораторних умовах передбачає багаторазове розмноження різних ділянок ДНК і РНК з метою знаходження тієї самої порушеної ланки. Ампліфікуються (подвоюються) кислоти за допомогою ферментних препаратів. Використовуючи ферменти, лаборант отримує достатню кількість копій патогенної ділянки ДНК для порівняння ПЛР його із зразками тих чи інших хвороб, спровокованих інфекцією.

Як правило, використовуються біологічні матеріали, взяті шляхом забору чи мазка. Для ідентифікації (розшифрування венеричних інфекцій) на ПЛР береться мазок з піхви, шийки матки або сечівника. Іноді використовується також сеча.

Щоб підтвердити чи спростувати наявність гепатиту, токсоплазмозу чи ВІЛ, беруть кров із вени. Кров, забрана з пальця, часто дає помилково-негативні результати. Мононуклеоз діагностують після збирання матеріалу мулу зіва. Туберкульоз можна виявити після збирання мокротиння, яке рясно виділяється у хворих у ранкові години.

Мазок із піхви та шийки матки на ПЛР – простий аналіз, лякатися якого не варто. За 2-3 дні до його проведення слід відмовитися від статевого життя. Протягом цього часу забороняється використовувати для особистої гігієни гелі і мило на лужній основі. Підмиватися можна звичною теплою водою з-під крана. Останнє підмивання – увечері перед ранковим відвідуванням лабораторії чи лікарського кабінету.

Лікування молочниці за допомогою кремів, мазей, свічок чи спреїв, якщо воно проводиться, також бажано припинити. Мазок здається у перші кілька діб після менструації або відразу після неї. Для отримання точніших результатів рекомендується не відвідувати туалет 2-3 години перед забором мазка ПЛР.

У чоловіків на ланцюгову реакцію беруть мазок із уретри. Біологічний матеріал забирають за допомогою стерильного зонда або ватного тампона, що вводиться в сечівник. Під час процедури може виникнути невеликий дискомфорт або відчуття печіння. Чоловікам також доведеться тимчасово відмовитися від сексу та засобів гігієни. За тиждень до аналізу припиняється лікування антибіотиками та іншими препаратами. Якщо дискомфорт після забору зберігається, рекомендується скоріше звернутися до поліклініки.

Допустимо, у дослідженні використовується кров або мазок, взятий із статевих органів пацієнта. Генетичний матеріал поміщається в прилад-ампліфікатор ПЛР, туди ж додаються ферменти. ДНК нагрівається до 90-95 ° С до руйнування ланцюжка на кілька ланок. Цей процес називається денатурацією. Під час роботи реактора з одного зразка ДНК та РНК створюються тисячі придатних для аналізу (розшифрування реакції) результату його копій.

Результати діагностики ПЛР

Ланцюгова реакція показує як наявність інфекції, а й точну кількість наявних збудників. Розробка останніх років - штучне введення мутаційних генів у ДНК людини з метою виявлення схильності до зміни генотипу.

Що виявляє діагностика інфекцій ПЛР?

Розшифровка результатів аналізу зазвичай проглядається окремим лікарем. Можливості ланцюгової реакції дозволяють підтвердити або спростувати наявність таких хвороб:

Як зрозуміло з цього списку, ПЛР діагностика дарує лікарям багатьох вузькоспрямованих спеціальностей необмежені можливості. Застосовувати метод можна в пульмонології, вірусології, інфекціології, онкології, гастроентерології, гематології, гінекології та урології.

ПЛР розшифровка: результати

Аналізи ланцюгової реакції оцінюються лише лікарями індивідуально для кожного пацієнта з урахуванням наявних патологій та хронічних хвороб. Результати аналізів ПЛР вказують, як сказано вище, на кількісні характеристики патогенних бактерій. Звіряючись з ними, лікар встановить ступінь тяжкості та стадію захворювання. Виходячи з цих показників, надалі призначається дозування препаратів та тривалість курсу прийому.

Негативний результат ПЛР означає, що у забраному біологічному матеріалі відсутні прояви будь-яких вірусів та інфекцій. Позитивний ПЛР - сигнал до тривоги. Отже, у крові та інших біологічних рідинах пацієнта виявлено інфекцію.

Якщо значення мінімальні, це може свідчити про просте носійство хвороби, а не лише про активний розвиток захворювання. Простий переносник інфекції, виявлений тільки при ПЛР, але не виявляє жодних інших симптомів, повинен постійно спостерігатися у лікаря.

Важливо не піддаватися паніці і пам'ятати про те, що більшість відомих науці вірусів піддається лікуванню антибактеріальними препаратами. Підбирати їх та замінювати один одним при неефективності може лише кваліфікований фахівець, який має досвід у лікуванні тієї чи іншої хвороби.

Розшифровка ПЛР може бути проведена не лише на вимогу лікаря, а й за власним волевиявленням. Часто його роблять жінки, які найближчим часом планують вагітність, щоб переконатися у відсутності венеричних захворювань. При постановці на облік у районній консультації у вагітної все одно виникне потреба у проходженні цього діагностики.

Призначають ПЛР обов'язково жінкам, які мали кілька абортів або викиднів з різних причин. Перед ЕКЗ проводять аналіз для усунення всіх причин можливого відторгнення плодового яйця.

Чоловіки схильні проводити ПЛР після відпустки, під час якої був курортний роман або навіть кілька. Діагностика допомагає їм не ставити під загрозу своє життя та здоров'я потенційних сексуальних партнерок.

Часто ПЛР стає єдиним шансом для пацієнта позбутися хвороби на початковому етапі, коли нікчемний ризик ускладнень та тяжкого перебігу.

Мазок методом ПЛР у діагностиці інфекційних захворювань має наступні переваги:

Пряме визначення збудників інфекційних захворювань.

Багато традиційних методів лабораторної діагностики мають на увазі виявлення збудників захворювання за різними непрямими ознаками. Наприклад, ІФА-діагностика заснована на виявленні у крові пацієнта білків, які є продуктами розпаду інфекційних збудників, на підставі чого лікар може поставити той чи інший діагноз. Метод ПЛР-аналізу дає пряму вказівку на присутність у забраному у пацієнта матеріалі специфічної ділянки ДНК збудника хвороби.

Висока специфічність ПЛР-діагностики.

У процесі проведення аналізу у досліджуваному матеріалі виділяється фрагмент ДНК, специфічний, тобто властивий лише конкретному збуднику – лише певної бактерії чи вірусу. Дана ділянка ДНК унікальна і не характерна для жодної інфекції на землі.

Висока чутливість ПЛР.

Виявлення інфекції можливе навіть у тому випадку, якщо у забраному у пацієнта матеріалі міститься лише одна клітина бактерії чи вірусу. Порівняно з іншими імунологічними та мікробіологічними методами діагностики: чутливість ПЛР-аналізу – 10-100 клітин у пробі, інші методи – 103-105 клітин.

0Array (=> Аналізи) Array (=> 2) Array (=>.html) 2

Універсальність ПЛР-аналізу.

Для ПЛР-дослідження може застосовуватися практично будь-які матеріали, у тому чилі недоступні для дослідження іншими методами: слиз, сеча, кров, сироватка, мокротиння, еякулят, зіскрібок епітеліальних клітин - оскільки інфекція може міститися в будь-яких біологічних виділеннях і тканинах.

Висока швидкість одержання результату ПЛР-аналізу.

Єдиний для всіх метод обробки забраного на аналіз у пацієнта матеріалу, детекції продуктів реакції, автоматизована ПЛР-ампліфікація дозволяють провести повну ПЛР-діагностику за 4-5 годин. У той же час, на культуральні методи дослідження витрачається набагато більше часу — від кількох днів до кількох тижнів, оскільки необхідне виділення, а згодом і вирощування збудника на культурі клітин.

Можливість діагностики будь-якого виду інфекції.

Висока чутливість методу ПЛР дозволяє діагностувати інфекцію не лише на гострій стадії захворювання, а й хронічні інфекції та навіть наявність поодиноких бактерій чи вірусів.

Мазок методом ПЛР дозволяє виявити інфекції, які неможливо виявити у мазку на флору: хламідіоз, уреаплазмоз, мікоплазмоз, генітальний герпес.

Якими б значними перевагами не мав метод дослідження, а й ПЛР-діагностика має деякі обмеження. До недоліків ПЛР-діагностики можна віднести:

Можливість отримання хибнопозитивного результату

ПЛР-аналіз може показати позитивний результат навіть у тому випадку, якщо інфекція вже мертва, «вбита» антибіотиками, але її мертві клітини все ще містяться в тканинах пацієнта. Як таке можливо? Дуже просто. Наприклад, інфекція живе в клітинах епітелію (на слизовій оболонці статевих органів або очей). І її полікували. Але для «оновлення» клітин епітелію потрібен час. Якщо матеріал буде забраний лікарем до повного оновлення клітин, у матеріалі можуть міститися мертві клітини інфекції. Клітини, очевидно, містять генетичний матеріал - ДНК або РНК збудника, який і шукає ПЛР. ПЛР не відрізняє мертві клітини від живих: вона шукає ДНК і «клонує» їх у величезних кількостях. Результат такого аналізу є позитивним. Насправді ж він є хибнопозитивним.

Нездатність ПЛР «відрізнити» мертву інфекцію від живої накладає певні вимоги при використанні ПЛР і контролю ефективності лікування. Основне правило, звичайно ж, дочекатися повного виведення мертвих залишків інфекції з організму, що середня людина відбувається протягом 4-8 тижнів. Після цього терміну після прийому останньої таблетки антибіотика метод ПЛР можна і потрібно використовувати для контролю ефективності проведеного лікування.

гастроентерологія діагностичний комплекс - 5360 рублів

ТІЛЬКИ В БЕРЕЗНІ економія - 15%

1000 рублів зняття ЕКГ із розшифровкою

- 25%первинний
прийом лікаря
терапевта у вихідні

980 руб. первинний прийом гірудотерапевта

прийом терапевта - 1130 рублів (замість 1500 рублів) "Тільки в березні, по суботах і неділях, прийом лікаря-терапевта зі знижкою 25% - 1130 руб., замість 1500руб. (діагностичні процедури оплачуються за прейскурантом)

На більш ранніх термінах контроль вилікуваності можна зробити тільки за допомогою культурального методу, або посіву: ознакою невиліковності можуть служити тільки життєздатні мікроорганізми, що розмножуються.

Небажано використовувати ПЛР-аналіз для діагностики гарднереллеза, так як гарднерелли - збудники цього захворювання в невеликій кількості в нормі живуть у піхві. ДНК цих бактерій при використанні ПЛР буде щоразу перебувати. Гарднерелл не має бути в мазку, і бактеріоскопія в даному випадку – достатній метод для діагностики гарднереллезу та контролю лікування.
Мінливість мікроорганізмів

Будь-який мікроб має здатність змінюватися, причому на рівні ДНК. Найяскравіший приклад із цієї галузі – це вірус грипу. Перехворівшись одного разу, на вірус у людини виробляються антитіла. Чисто теоретично, якщо ми перехворіли на грип хоч один раз, то як і на вітряний, вдруге ми хворіти не повинні. Але вболіваємо ми практично щороку. В чому причина? Вірус «мутує», трохи «змінюючи» свій геном, і наша імунна система, наші антитіла вже «не впізнають» старого гостя у новому вигляді. Як не сумно, доводиться хворіти на грип наново...

При проектуванні ампліфікатора (тестової ПЛР-системи) використовують специфічний для даного мікроорганізму фрагмент ДНК, найменш схильний до змін. Він «вибирається» з так званої висококонсервативної ділянки ДНК. Але мінливість мікроорганізмів може призводити до того, що деякі генотипи або штами досліджуваного збудника можуть набувати мутації в ділянці геному, що ампліфікується (клонується), і, таким чином, ставати невловимими даної тест-системою.

Таким чином, різні тест-системи - одна з причин, чому аналізи, зроблені в різних лабораторіях і в різних клініках одним і тим же методом ПЛР можуть показувати діаметрально протилежні результати. Щоб максимально уникати помилок з вини мутацій, в даний час розроблені стандарти, що регламентують обсяг випробувань (включаючи перевірку на перехресні реакції, а також тестування відомих штамів збудника, що визначається), які повинна витримати тест-система, перш ніж вона потрапить на ринок і буде використана для діагностики вашого здоров'я Ось чому хороші клініки та лабораторії використовують останні покоління тест-систем. І наш медичний центр «Євромедпрестиж» один із небагатьох, хто може запропонувати своїм клієнтам якісну діагностику.