У дома Лекарства Относно диагностиката на наследствени метаболитни заболявания при деца чрез тандемна мас спектрометрия на територията на Свердловска област. Съвременни проблеми на науката и образованието Как да подготвим бебе за изследвания

Относно диагностиката на наследствени метаболитни заболявания при деца чрез тандемна мас спектрометрия на територията на Свердловска област. Съвременни проблеми на науката и образованието Как да подготвим бебе за изследвания

Тандемната масспектрометрия е един от съвременните методи за анализ на съединения, който се използва широко за различни научни и практически цели. Този метод позволява анализ на няколко стотици съединения в микро-количества биологичен материал. В световната здравна практика този метод се използва за провеждане на масов скрининг на новородени за наследствени метаболитни заболявания (NBD). В петна от изсъхнала кръв е възможно да се определят аминокиселини (включително фенилаланин) и ацилкарнитини. Количественото определяне на тези вещества дава възможност да се изключат няколко десетки наследствени заболявания, принадлежащи към различни класове NBO (нарушения на метаболизма на аминокиселини, органични киселини и дефекти в митохондриалното β-окисление на мастните киселини). Преди това диагностиката на тези нарушения изискваше голямо количество биологичен материал, няколко проучвания (анализ на аминокиселини, хроматомасна спектрометрия, определяне на спектъра на ацилкарнитини), които изискват значителни времеви и материални разходи. TMS ви позволява да определите количествено всички тези съединения в един анализ! Наследствените нарушения на метаболизма на аминокиселини, органични киселини и дефекти в митохондриалното бета-окисление на мастни киселини имат около 100 нозологични форми, повечето от които се проявяват в неонаталния период. Честотата им е повече от 1: 5000 живородени. Много лекари погрешно вярват, че болестите от тази група са толкова редки, че трябва да бъдат изключени само в краен случай и много често правилната диагноза се установява на по-късна дата или заболяването изобщо не се диагностицира.

По време на анализа се определят 52 показателя (аминокиселини и ацилкаринини)

4, 1

1 FSBI "Център за медицински генетични изследвания" на Руската академия на медицинските науки

2 SBEE HPE "Ростовски държавен медицински университет към Министерството на здравеопазването на Русия"

3 GBUZ "Регионална клинична болница № 1 на името на професор С. В. Очаповски" от Министерството на здравеопазването на Краснодарския край

4 FSBI "Център за медицински генетични изследвания"

За да се обоснове въвеждането на масов скрининг на новородени за наследствени метаболитни заболявания (NBO) чрез тандемна масспектрометрия (MS / MS), беше проведено ретроспективно проучване на архивирани кръвни проби на деца (n \u003d 86), починали през първата година от живота. Промени в профилите на аминокиселини и ацилкарнитини бяха открити в 4 случая (4.7%). В един от тях е установено многократно повишаване на концентрацията на левцин, изолевцин и валин, специфично за заболяването на миризмата на урина от кленов сироп. Клиничната картина и откриването на мутация в първия екзон на гена BCKDHB (c.98delG) в хетерозиготно състояние косвено потвърди диагнозата левциноза. В останалите три случая разкритите промени в профила на аминокиселините и ацилкарнитини не са със същия специфичен характер. В тези случаи ще са необходими повторни кръвни изследвания по метода MS / MS, допълнителни клинични и биохимични изследвания. В резултат на проучването беше потвърдена необходимостта от въвеждане на метода MS / MS в програмите за неонатален скрининг за NBO за навременната им диагностика и лечение.

ретроспективна диагноза

тандемна мас спектрометрия

наследствени метаболитни заболявания

1. Krasnopolskaya KD Наследствени метаболитни заболявания. Справочник за лекари. - М.: РПО „Център за социална адаптация и рехабилитация на деца„ Фохат “, 2005. - 364 с.

2. Михайлова С. В., Захарова Е. Ю., Петрухин А. С. Неврометаболични заболявания при деца и юноши. Диагностика и подходи за лечение. - М.: „Literra“, 2011. - 352 с.

3. Chace H. D. Бърза диагностика на MCAD дефицит количествен анализ на октаноилкарнитин и други ацилкарнитини в новородени кръвни петна чрез тандемна мас спектрометрия / Chace H. D., Hillman S. L., Van Hove J. L. et al. // Клинична химия. - 1997. - V. 43. - No 11. - С. 2106-2113.

4. Nyhan L. W., Barshop B. A., Ozand P. T. Атлас на метаболитните заболявания. - Второ издание. - Лондон: Hodder Arnold, 2005. - 788 с.

5. Rashed M. S. Клинично приложение на тандемна масспектрометрия: десет години диагноза и скрининг за наследствени метаболитни заболявания // J. of Chrom. Б. - 2001. - V. 758. - No 27-48.

6. Sweetman L. Нарушения на именуването и преброяването (counditions), включени в скрининговите панели за новородени / Sweetman L., Millington D. S., Therrell B. L. et al. // Педиатрия. - 2006. - V. 117. - С. 308-314.

7. Van Hove J. L. Средноверижен дефицит на acl-CoA дехидрогеназа: диагностика чрез анализ на ацилкарнитни в кръвта / Van Hove J. L., Zhang W., Kahler S. G. et al. // Изм. J. Hum. Genet. - 1993. - V. 52. - С. 958-966.

Въведение

Към днешна дата са известни повече от 500 нозологични форми на наследствени метаболитни заболявания (NBO). По-голямата част от NBO са изключително редки, но общата им честота в популацията е 1: 1000-1: 5000. Като правило, NBO се проявяват през първата година от живота с неспецифични симптоми, като ги клинично маскират под друга, ненаследствена соматична патология. В същото време е важна навременната диагностика на метаболитни наследствени заболявания, тъй като за много от тях са разработени и продължават да се развиват ефективни методи на патогенетично лечение, без които резултатът от болестите често остава фатален. Общоприето е, че един от най-оправданите и ефективни подходи за ранно откриване на наследствена патология е генетичният скрининг на новородените. Развитието на метода на тандемна масспектрометрия (MS / MS) с електроспрей йонизация направи широкомащабен масспектрометричен скрининг, приложим в практиката на масово изследване в NBO в края на 90-те години на XX век. Този силно чувствителен микрометод дава възможност едновременно да се определят в няколко микролитра кръв концентрациите на десетки аминокиселини и ацилкарнитини, които са важни за диагностицирането на NBO. Ефективността на лабораторния тест MS / MS направи възможно включването му в държавни програми за неонатален скрининг на новородени за аминоацидопатия, органична ацидурия и дефекти в митохондриалното β-окисление на мастни киселини в редица страни. Независимо от това, в Руската федерация методът MS / MS не е въведен в системата за масов скрининг на новородени и е достъпен за селективен скрининг за NBO само в отделни федерални медицински центрове.

Целта на това проучване беше научно да обоснове необходимостта от включване на MS / MS изследвания за диагностика на аминоацидопатии, органични ацидурии и митохондриални дефекти на β-окисляване на мастни киселини в регионални програми за масов скрининг на новородени въз основа на ретроспективен масспектрометричен анализ на кръвни проби от болни деца, чиито заболявания са приключили. летален изход през първата година от живота.

Пациенти и изследователски методи

Това ретроспективно проучване включва деца (n \u003d 86, съотношението момчета: момичета 48/38), които са починали през първата година от живота (на възраст от 5 дни до 11 месеца от живота) през една календарна година (2010) на административната територия на Краснодарския край ... Изследването включва деца с вродени малформации (n \u003d 29), инфекциозни заболявания - пневмония, сепсис, бактериален менингоенцефалит (n \u003d 37), перинатално увреждане на ЦНС (n \u003d 11), синдром на внезапна смърт (n \u003d 6) и други заболявания ( п \u003d 3). Контролната група се състоеше от 438 клинично здрави новородени (227 момичета, 211 момчета) на възраст 3-8 дни. В тази група референтните стойности на концентрациите на аминокиселини и ацилкарнитини в капилярна кръв са определени при здрави деца от неонаталния период.

Материалът за изследването са архивирани проби от периферна кръв върху стандартни хартиени тестови форми, получени на 3-8 дни от живота за стандартен неонатален скрининг. Концентрацията на аминокиселини и ацилкарнитини (Таблица 1) в кръвта се определя чрез тандемна масспектрометрия (MS / MS) с помощта на квадриполен тандемен масспектрометър Agilent 6410 (Agilent Technologies, САЩ) съгласно сертифицирания метод на CHROMSYSTEM № V1 07 05 57136 001. Проучването е извършена в лабораторията по медицинска генетика на Ростовския държавен медицински институт към Министерството на здравеопазването на Русия.

маса 1

Метаболити, определени от MS / MS

	Метаболит	Символ	Метаболит	Символ
*A m in o k и слотове*
			3-метилкротонилкартин
	Аспарагинова киселина		3-хидроксиизовалерилкарнитин
	Глутаминова киселина		Хексаноилкарнитин
	Левцин + Изолевцин		Октаноилкарнитин
	Метионин		Октеноилкарнитин
	Фенилаланин		Деканоилкарнитин
			Деценоилкарнитин
			Додеканоилкарнитин
			Миристилкарнитин
	Цитрулин		Тетрадеценоилкарнитин
			Тетрадециноилкарнитин
			Хидроксимиристилкартин
*A ts и lkar n и t в s*			Палмитоилкарнитин
	Безплатен карнитин		Хексадеценоилкарнитин
	Ацетилкарнитин		Хидроксихексадеценоилкарнитин
	Пропионилкарнитин		Хидроксипалмитоилкарнитин
	Малонилкарнитин		Стеароилкарнитин
	Бутирилкартин		Олеоилкарнитин
	Метилмалонилкарнитин		Хидроксистеароилкарнитин
	Изовалерилкартин		Хидроксиолеоилкарнитин
	Глутарилкарнитин		Хидроксилиноилкарнитин

Статистическата обработка на получените данни беше извършена с помощта на софтуерния пакет Statistica 6.0 и електронни таблици Excel 2007. За определяне на описателните числени характеристики на променливите бяха използвани стандартни методи за статистически анализ: изчисляване на медианата, 0,5 и 99,5 процентила.

За потвърждаваща молекулярно-генетична диагноза на левциноза, ДНК е изолирана от сухи кръвни петна с помощта на реактивен комплект DiatomDNAPrep (Biocom LLC, Русия). Изборът на праймери за PCR амплификация се извършва за 10 екзона на гените BCKDHA и BCKDHB. Секвенирането на PCR фрагменти с цел откриване на редки мутации се извършва съгласно протокола на производителя на генетичен анализатор ABIPrism 3500 (Applied Biosystem, САЩ).

Резултати от изследванията и тяхното обсъждане

В резултат на изследване на концентрациите на аминокиселини и ацилкарнитини в периферната кръв на 438 клинично здрави новородени бяха определени 0,5 и 99,5 процентилни концентрации на изследваните метаболити, които използвахме по-късно като референтни стойности (Таблица 2). Сравнението на концентрациите на аминокиселини и ацилкарнитини, определени в кръвни проби на 86 деца, починали през първата година от живота, с референтните стойности на концентрация, показва, че при 82 пациенти (95,3%) нито един от изследваните параметри не надвишава 0,5 и 99, 5 процентила от контролната група, което позволи да се изостави работната версия за наличието на метаболитни нарушения на аминокиселини и карнитини, които не бяха проверени in vivo. При 4 деца (4,7%) обаче концентрациите на някои аминокиселини и ацилкарнитини са няколко пъти по-високи от горните граници на референтния интервал в контролната група (Таблица 2).

таблица 2

Резултати от ретроспективна оценка на концентрациите на аминокиселини и ацилкарнитини при новородени (n \u003d 4) с ниво на отделни метаболити извън диапазона от 0,5-99,5 процентила

	Метаболити	Концентрации на отделни метаболити (μmol / L)
		Референтни стойности на контролната група (n \u003d 438) в диапазона 0,5-99,5 процентила	Индивидуални стойности за пациента (n \u003d 4) *
			Пациент 1	Пациент 2	Пациент 3	Пациент 4
*A m in o k и слотове*



			2503,868






						1457,474

*A ts и lkar n и t в s*

* Забележка:

Пациент 1 - момче KM (диагноза: обструктивен бронхиолит), починало на възраст 11 месеца;

Пациент 2 - момче CF (диагноза: пневмония), починало на възраст 1 месец;

Пациент 3 - женски PV (диагноза: сепсис), починал на възраст 12 дни.

Пациент 4 - момиче ПА (диагноза: пневмония), починало на възраст 6 дни.

В първия случай при пациент с CM, починал на възраст от 11 месеца с диагноза обструктивен бронхиолит, тандемната масова спектрометрия на аминокиселини и ацилкарнитини в архивирани кръвни проби разкрива промени в съдържанието на левцин, изолевцин и валин, които са доста специфични по природа, за да говорят за голяма вероятност за вродени метаболитен дефект по пътя на катаболизма на левцин и изолевцин. В изследваните архивни кръвни проби е установено повишаване на концентрацията на левцин и изолевцин с повече от 9 пъти и на валин с повече от 3 пъти в сравнение с референтните стойности, което предполага диагностициране на заболяване с мирис на урина от кленов сироп.

От наличните клинични данни в полза на левциноза при дете с БМ са установени следните клинични прояви: ранно отхвърляне на кърменето, симптоми на неонатална енцефалопатия, увеличаване на неврологичните симптоми - промени в мускулния тонус, гърчове, епилепсия, забавено психомоторно развитие. Детето често е имало тежки инфекции на дихателните пътища, които са причинявали облитериращ бронхиолит, който е бил причина за смъртта на възраст от 11 месеца. Нямаме информация дали детето е имало специфична миризма на урина, но повишаване на концентрацията на метаболити, типични за левциноза и характерни клинични симптоми потвърждават нашето предположение. В допълнение, диагностицирането на болестта на миризма на кленов сироп се подкрепя от резултатите от ДНК диагностиката на левциноза, използвайки архивирани кръвни проби. Молекулярно-генетичният анализ разкрива при детето делецията на c.98delG в първия екзон на гена BCKDHB в хетерозиготно състояние. Същата мутация се открива и в кръвта на майката. Поради ограничения брой архивирани кръвни проби на детето и недостъпността на биологичен материал от баща му, втората мутация не можа да бъде открита. Въпреки това, комбинация от клинични, биохимични и молекулярно генетични данни подкрепя диагностицирането на левциноза (или кленов сироп, ухаеща на урина, MIM ID 248600) в изследвания случай.

В останалите три случая разкритите промени в профила на аминокиселините и ацилкарнитини не са от същия специфичен характер, както в предишния случай. В тези случаи е невъзможно да се приемат определени NBO, базирани на данни от MS / MS, и още повече да се твърди със сигурност. За диференциална диагноза на аминоацидопатии и органични ацидурии, повторни кръвни тестове по метода MS / MS, ще са необходими допълнителни клинични и биохимични изследвания.

Увеличението на специфичните за заболяването метаболити е променливо и зависи от много фактори. Диетата на детето, приемането на някои лекарства трябва да се вземе предвид при тълкуване на резултатите. Така че, приемът на лекарства, съдържащи валпроева киселина или средно-верижни триглицериди, води до повишаване на C6, C8 и C10, което усложнява диагностиката на дефицит на ацил-CoAdehydrogenase със средна верига. Приемът на съдържащи карнитин лекарства също може да доведе до повишени концентрации на къси и средноверижни ацилкарнитини. Съдържанието на дълговерижни ацилкарнитини в плазмата и цялата кръв е различно, тъй като те са свързани с мембраните на еритроцитите, поради което хематокритният индекс има определена стойност. С някои изключения едно и половина до двукратно увеличение на концентрацията изисква втори кръвен тест. По този начин нивата на патогномоничните метаболити за пропионова и изовалерианска ацидурия обикновено се повишават с повече от 5 пъти и дори леко изменение в концентрацията на глутарилкарнитин изисква не само повторен кръвен тест, но и допълнително изследване на органични киселини в урината, характерни за глутарна ацидурия от тип I.

Заключение

Ретроспективно проучване на кръвни проби от малки деца, починали от различни причини, проведено по метода MS / MS, ни позволи да предположим в редица случаи наследствена метаболитна патология. В един от тях диагнозата на заболяването се потвърждава от миризмата на кленов сироп урина (левциноза). Навременните диагностични мерки в такива случаи са важен компонент в диференциалната диагноза на вродени метаболитни грешки. Изследването на концентрацията на аминокиселини и ацилкарнитини в проби от биологични течности може да бъде от диагностично значение при анализа на случаи на детска смъртност. Посмъртната диагноза на наследствено метаболитно заболяване при починало дете е индикация за медицинско генетично консултиране на семейството. Необходимо е широко прилагане на метода MS / MS при неонатален скрининг като основно средство за откриване на аминоацидопатии, органични ацидемии и дефекти при окислението на β-митохондриални мастни киселини при новородени за навременна диагностика и лечение на NBO.

Рецензенти:

Полевиченко Елена Владимировна, д-р мед. Sci., Професор, главен изследовател на отдела за рехабилитация и медицинско и социално подпомагане на Федералната държавна бюджетна институция "Федерален изследователски център по детска хематология, онкология и имунология на името на Дмитрий Рогачов" на Министерството на здравеопазването на Русия, Москва.

Михайлова Светлана Виталиевна, д-р мед. Sci., Ръководител на отдела по медицинска генетика, Руска детска клинична болница към Министерството на здравеопазването на Русия, Москва.

Библиографска справка

Байдакова Г.В., Антонец А.В., Голихина Т.А., Матулевич С.А., Амелина С.С., Куцев С.И., Куцев С.И. РЕТРОСПЕКТИВНА ДИАГНОСТИКА НА НАСЛЕДНИ БОЛЕСТИ НА ОБМЕНЕН МЕТОД НА ТАНДЕМНА МАСОВА СПЕКТРОМЕТРИЯ // Съвременни проблеми на науката и образованието. - 2013. - No2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id\u003d8953 (дата на достъп: 12.12.2019 г.). Предлагаме на вашето внимание списанията, публикувани от "Академия по естествени науки"

Според преглед, публикуван в Clinical Biochemist Reviews, използването на високоефективна течна хроматография в комбинация с тандемна масспектрометрия (HPLC-MS / MS) в клиничните лаборатории се е увеличило неимоверно през последните 10-12 години. Авторите отбелязват, че специфичността на HPLC-MS / MS анализ значително превъзхожда имунологичните методи и класическата високоефективна течна хроматография (HPLC) при анализа на молекули с ниско молекулно тегло и има значително по-висока производителност от газовата хроматография-мас спектрометрия (GC-MS). Популярността на този метод в рутинните клинични анализи в момента се обяснява с уникалните възможности на метода.

Точен количествен анализ на малки молекули;
Едновременен анализ на множество целеви съединения;
Уникална специфичност;
Висока скорост на анализ.

През последните години се отделя много внимание на времето за анализ и в резултат на това на увеличаването на лабораторната производителност. Значително намаляване на времето за анализ стана възможно чрез използването на кратки аналитични колони за HPLC / MS / MS, като същевременно драстично се увеличи специфичността на анализа. Използването на йонизация при атмосферно налягане (API), тандемен троен квадруполен масспектрометър и усъвършенствана високоефективна течна хроматография, както и свързани техники за подготовка на проби, поставят HPLC-MS / MS в челните редици на съвременните аналитични методи за клинични изследвания.

Получаване на пълен профил на метаболизма на стероиди (стероидни панели), пурини и пиримидини и други съединения,
скрининг на новородени за вродени метаболитни грешки (откриване на няколко дузини заболявания в един анализ);
Терапевтично наблюдение на лекарствени продукти - имуносупресори, периоконвулсанти, антиретровирусни средства, антикоагуланти и всякакви други - независимо от наличността на комплектите на производителя. Не е необходимо да купувате скъпи комплекти за всяко вещество - можете да разработите свои собствени методи;
Клинична токсикология - анализ на повече от 500 наркотични съединения и техните метаболити в един анализ, без потвърдителен анализ
протеомика и метаболомика.

В допълнение, HPLC-MSMS се използва за скрининг на олигозахариди в урината, сулфатид, дълговерижни мастни киселини, дълговерижни жлъчни киселини, метилмалонова киселина, изследвания на порфирия, скрининг на пациенти с нарушен метаболизъм на пурина и пиримидина.

Примери за приложение за течна хроматография
в комбинация с тандемна мас спектрометрия при клинични анализи.

Скрининг за новородено: Първият пример за масово използване на HPLC-MS / MS в клиничната диагностика е скринингът на вродени метаболитни грешки при новородени. Понастоящем в развитите страни това е рутинен метод и обхваща над 30 различни заболявания, включително ацедемия, аминоацидопатия и дефекти на окисляване на мастните киселини. От особено значение са изследванията върху вродените дефекти, които могат да доведат до сериозни проблеми, освен ако не се предприемат незабавни действия (напр. Разширено сърце или черен дроб или мозъчен оток). Предимството на използването на HPLC-MS / MS за скрининг на новородено е способността да се анализират едновременно всички аминокиселини и ацилкарнитини по бърз, евтин и силно специфичен метод.

Терапевтично наблюдение на лекарството: Разработването и въвеждането на имуносупресора сиролимус (рапамицин) за предотвратяване на отхвърляне на органи след трансплантация е един от основните стимули за въвеждането на HPLC-MS / MS в клиничните лаборатории. Съвременният HPLC-MS / MS метод позволява едновременно определяне на такролимус, сиролимус, циклоспорин, еверолимус и микофенова киселина.

HPLC-MS / MS се използва също за анализ на цитотоксични, антиретровирусни лекарства, трициклични антидепресанти, антиконвулсанти и други лекарства, които изискват индивидуална доза.

Методът HPLC-MSMS позволява да се отделят и количествено определят R- и S-енантиомерите на варфарин в концентрационния диапазон от 0,1-500 ng / ml.

Наркотици и болкоуспокояващи: HPLC-MS / MS се използва широко за анализ на тези съединения поради простотата на подготовката на пробата и краткото време за анализ. Понастоящем методът се използва в клинични лаборатории за скрининг на широк спектър от лекарства. Уникалната специфичност и чувствителност на метода дава възможност едновременно да се анализират повече от 500 съединения от различни класове в една проба с минимална подготовка на пробата. Така че, в случай на анализ на урина е достатъчно просто разреждане на пробата от 50-100 пъти. Когато се анализира косата, вместо сноп от 100-200 косми, една коса е достатъчна, за да се идентифицират надеждно фактите за употребата на наркотици.

Ендокринология и стероиден анализ: HPLC-MS / MS се използва широко в много ендокринологични лаборатории за анализ на стероиди - тестостерон, кортизол, алдестерон, прогестерон, естриол и много други.

Все повече лаборатории започват да използват HPLC-MS / MS за определяне на нивата на витамин D3 и D2 в кръвта.

I. Определение на стероиди (стероиден профил).

Лабораториите в болниците и клиниките вече имат възможност да извършват HPLC / MS / MS едновременно определяне на множество стероиди. В същото време няма нужда от голям обем на пробата, което е особено важно при анализ на детски проби.

II. Определяне на хормоните на щитовидната жлеза

Рутинните методи за определяне на хормоните на щитовидната жлеза обикновено се основават на радиоимуноанализ, който е скъп и открива само Т3 и Т4, които могат да ограничат способността за определяне и пълно регулиране на функцията на щитовидната жлеза.

В момента, когато се използва HPLC-MSMS, се анализират едновременно пет хормона на щитовидната жлеза в проби от кръвен серум, включително тироксин (Т4), 3,3 ', 5-трийодтиронин (Т3), 3,3', 5'- (rT3), 3 , 3'-дийодтиронин (3,3'-Т2) и 3,5-дийодтиронин (3,5-Т2) в концентрационния диапазон 1-500 ng / ml.
Методът HPLC / MS / MS също се използва за анализ на хормоналния състав на пациенти, подложени на тиреоидектомия. Определят се нивата на концентрация на тироксин (Т4), трийодтиронин (Т3), свободен Т4 и тироид стимулиращ хормон (TSH) след операция. Установено е, че HPLC / MS / MS е отличен начин за установяване на връзката между концентрацията на TSH и щитовидната жлеза.
Методът HPLC / MS / MS се използва за определяне на тироксин (Т4) в човешката слюнка и серум. Методът се характеризира с висока възпроизводимост, точност и граница на откриване от 25 pkg / ml. Проучванията показват, че съществува диагностична връзка в концентрациите на слюнчените Т4 между субекти с еутиреоидна жлеза и пациенти с болест на Грейвс.

Методът HPLC / MS / MS вече има чувствителността, специфичността и точността, необходими за надеждно определяне на всички стероиди в биологични течности и по този начин подобрява диагностичните възможности, особено в случай на стероидни комплекти.

III. Определяне на 25-оксивитамин D чрез HPLC / MS / MS

25-хидрокси витамин D (25OD) е основната циркулираща форма на витамин D и предшественик на активната му форма. (1,25-диоксивитамин D). Поради дългия си полуживот, определянето на 25OD е важно за определяне на състоянието на витамин D в тялото на пациента. Витамин D съществува в две форми: витамин D3 (холекалциферол) и витамин D2 (ергокалциферол). И двете форми се метаболизират до съответните 25OD форми. От голямо значение за диагностиката е наличието на аналитични методи, които могат да определят с висока точност и двете форми на витамина и да позволят проследяване на пациенти с нарушения в съдържанието на витамин D. Използваните до момента методи не позволяват отделно определяне на витамин D2 и D3. Освен това, при високи концентрации на витамин D2, подлежащото на откриване количество на D3 се подценява. Друг недостатък е използването на радиоактивни изотопи. Използването на метода HPLC / MS / MS направи възможно не само да се избегне използването на радиоактивни изотопи, но и да се извърши отделно определяне на двете активни форми на витамина.

Ако подозирате ниско съдържание на витамин D в организма;
Ако подозирате необясним токсичен ефект;
При изследване на пациенти, подложени на лечение за ниско съдържание на витамин D;
Използването на HPLC / MS / MS позволява отделно определяне на двете форми при наблюдение на пациентите.

IV. Определяне на имуносупресори чрез HPLC / MS / MS

След трансплантация на органи трябва да приемате имуносупресори през целия си живот, за да избегнете отхвърлянето. С много тесен терапевтичен диапазон и висока токсичност, имуносупресорите изискват индивидуална доза, за да увеличат максимално ефекта си. Следователно е жизненоважно да се наблюдават основните имуносупресори: циклоспорин А, такролимус, сиролимус и еверолимус, за да се коригира дозата на лекарството за всеки отделен пациент в зависимост от концентрацията на лекарството в кръвта.

Имуноанализът все още се използва за наблюдение на изброените лекарства, но тези методи са скъпи и тяхната специфичност, точност и възпроизводимост са ограничени. Известни са случаи на смърт на пациенти от грешна дозировка на имуносупресори въз основа на резултатите, получени с помощта на имунологични методи. В момента имуноанализите се заменят в клиничните лаборатории с HPLC / MS / MS. По този начин в клиниката на университета в Мюнхен около 70 проби се анализират ежедневно за съдържанието на сиролимус и циклоспорин А, като се използва HPLC / MS / MS система. Цялата подготовка на проби и контрол на инструмента се извършва от един човек. Лабораторията също преминава към анализ на такролимус с този метод.

Описано е използването на HPLC / MS / MS за рутинно едновременно определяне на такролимус, сиролимус, аскомицин, деметиксисиролимус, циклоспорин А и циклоспорин G в кръвта. Диапазонът, определен от концентрацията, е 1,0 - 80,0 ng / ml. За циклоспорин 25 - 2000 ng / ml. През годината в лабораторията бяха анализирани над 50 000 проби.
Тъй като беше установено, че едновременната употреба на такролимус и сиролимус дава положителен терапевтичен ефект, е разработен прост и ефективен HPLC / MS / MS метод за отделното им определяне в кръвта за клинични анализи. Анализът на една проба отнема 2,5 минути с точност 2,46% - 7,04% за такролимус и 5,22% - 8,30% за сиролимус за цялата аналитична крива. Долната граница на откриване за такролимус е 0,52 ng / ml, за сиролимус - 0,47 ng / ml.

V. Определяне на хомоцистеин чрез HPLC / MS / MS

Хомоцистеинът представлява интерес при сърдечно-съдови заболявания (тромбоемболия, сърдечни заболявания, атеросклероза) и други клинични състояния (депресия, болест на Алцхаймер, остеопороза, усложнения при бременност и др.). Съществуващите методи за анализ на хомоцистеин, включително имуноанализи, са скъпи. Разработен е бърз HPLC / MS / MS метод за анализ на хомоцистеин за рутинно клинично приложение при анализ на голям брой проби. Йонизацията се извършва по електроспрей метод. Методът е възпроизводим, силно специфичен и точен. Предимствата на метода са също ниска цена на реагентите и простота на подготовката на пробата. Възможно е да се анализират 500 или повече проби на ден.

Заключение

Трябва да се отбележи, че въпреки че в момента се използват значително подобрени методи за имунологичен анализ, поради технически фундаментални ограничения, този метод никога няма да има точност и специфичност за целевото вещество, сравними с HPLC-MSMS, особено в присъствието на метаболити. Това не само води до ниска точност на метода ELISA и висок процент на фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати, но също така не позволява да се сравняват резултатите, получени в различни клинични отдели, използващи метода ELISA. Използването на HPLC-MS / MS елиминира този недостатък, позволява високо специфичен, точен и бърз анализ на голям брой проби с висока надеждност в присъствието на метаболити и без намеса от съпътстващи и ендогенни вещества в плазмата и кръвта на пациентите.

Въпреки привидно високата цена на инструменталния комплекс, както показва световната практика, при правилна експлоатация този комплекс се изплаща за 1-2 години. Това се дължи преди всичко на ниската цена на анализ поради едновременния анализ на десетки и стотици съединения и липсата на необходимост от закупуване на скъпи диагностични комплекти. Освен това лабораторията има възможност самостоятелно да разработи всички необходими методи за анализ и да не зависи от производителя на комплектите.

Избор на правилната конфигурация на инструменталния комплекс

Съществуват голям брой различни методи за масова спектрометрия и типове мас спектрометри, предназначени да решат голямо разнообразие от проблеми - от структурна идентификация на сложни протеинови макромолекули с тегло стотици хиляди Далтона до рутинен количествен анализ на малки молекули с висока производителност.

За успешното решаване на задачата едно от основните условия е изборът на правилния тип оборудване. Няма универсален инструмент за решаване на целия спектър от аналитични задачи. По този начин устройство, предназначено да реши проблема с идентифицирането на микроорганизмите, не е в състояние да извършва количествен анализ на малки молекули. И обратно. Факт е, че въпреки общото име, това са напълно различни устройства, работещи на различни физически принципи. В първия случай това е времеви полетен масспектрометър с източник на лазерна йонизация - MALDI-TOF, а във втория - троен квадрупол с електроспрей йонизация - HPLC-MSMS.

Вторият най-важен параметър е изборът на правилната конфигурация на системата. Има няколко големи производители на оборудване за масова спектрометрия. Устройствата на всеки производител имат не само своите силни страни, но и слабости, за които обикновено предпочитат да мълчат. Всеки производител произвежда своя собствена линия устройства. Цената на един аналитичен комплекс варира от 100 000 до 1 000 000 или повече долара. Изборът на оптималния производител и правилната конфигурация на оборудването не само ще спестят значителни финансови ресурси, но и ще решат по-ефективно проблема. За съжаление има много примери, когато лабораторното оборудване е направено без да се вземат предвид тези фактори. Резултатът е празно оборудване, прахосани пари.

Третият фактор за успеха на лабораторията е персоналът. Масспектрометрите изискват висококвалифициран персонал. За съжаление, нито един руски университет няма курс по съвременна практическа масова спектрометрия, особено по отношение на клиничните приложения, а задачите за обучение на персонала на всяка лаборатория трябва да се решават сами. Естествено, 2-3 дни обучение по запознаване, проведено от производителя след стартиране на оборудването, е абсолютно недостатъчно, за да се разберат основите на метода и да се придобият умения за работа с устройството.

Четвъртият фактор е липсата на готови методи за анализ. Всяка лаборатория има свои приоритетни задачи, за решаването на които е необходимо да се разработят собствени методи. Това може да направи човек с поне 2-3 години опит с устройството. Производителите понякога предоставят една или две общи насоки от препоръчителен характер, но не ги адаптират за конкретни лабораторни задачи.

IN LLC "BioFarmExpert" специалисти с дългогодишен опит работят върху различни видове масспектрометри, както и разработването на методи и формулирането на високоефективни анализи. Следователно ние предлагаме следните услуги:

Избор на оптимална конфигурация на устройството за конкретни клиентски задачи.
Закупуване, доставка и пускане на оборудване от водещи производители на тандемни спектрометри. Обучение на персонала поетапно в рамките на една година от датата на пускане на оборудването.
Набор от готови методи и бази данни за решаване на основни клинични проблеми.
Разработване на методи за анализ и решаване на специфични проблеми на клиента в неговата лаборатория с участието на неговия персонал.
Методологична подкрепа на всички етапи на работа.

В продължение на много години се прави основно скрининг тестовеспецифични за всяка отделна болест. Например, PKU скринингът се основава на микробиологична или химична оценка на повишаване на фенилаланина.

Тази ситуация се промени напълно през последното десетилетие с появата на технологията за тандемна масова спектрометрия (TMS). Анализът на тандемната масова спектрометрия (TMS) може не само точно и бързо да открие повишен фенилаланин в кръвно петно \u200b\u200bпри новородено с по-малко фалшиви положителни резултати в сравнение с по-старите методи, но и да открие едновременно няколко десетки други биохимични аномалии.

Някои от тях вече са прожектирани индивидуални тестове... Например, много държави са използвали специфични тестове за откриване на повишения в метионин за откриване на тандемна спектрометрия (TMS) също се е доказал като надежден метод за ненатален скрининг за някои заболявания, които отговарят на критериите за скрининг, но им липсва по-рано надежден тест.

Например, недостатъчност на MCAD - заболяване на окисляването на мастни киселини, обикновено асимптоматично, но клинично установимо, когато пациентът има повишен катаболизъм. Откриването на дефицит на MCAD при раждането може да бъде жизненоважно, тъй като болните деца имат много висок риск от животозастрашаваща хипогликемия в ранна детска възраст при катаболни състояния, причинени от интеркурентни заболявания като вирусна инфекция.

Почти една четвърт от децата с недиагностициран дефицит на MCAD умират в първия епизод. С правилното лечение метаболитното нарушение може да бъде обърнато. Ако MCAD е недостатъчен, основната цел на скрининга е да предупреди родителите и лекарите за риска от метаболитна декомпенсация, тъй като децата са практически здрави между пристъпите и не се нуждаят от ежедневно лечение, освен да се изключи продължителното гладуване.

Все още използвайте тандемна мас спектрометрия (TMS) за неонатален скрининг остава под въпрос. В допълнение към предоставянето на бързо тестване на много заболявания, за които неонатален скрининг вече се прави или може да бъде оправдан, тандемната масова спектрометрия (TMS) също така открива новородени с вродени метаболитни грешки като метилмалонова ацидемия, които обикновено не са включени в скрининговите програми поради тяхната рядкост и трудности при осигуряването окончателна терапия, която предпазва от прогресивно неврологично влошаване.

Болести, открити чрез тандемна масспектрометрия

I. Аминоацидемия:
- PKU
- Болест на урината с мирис на кленов сироп
- хомоцистинурия
- цитрулинемия
- Аргинин кехлибарена ацидурия
- Тирозинемия тип I

II. Органична ацидемия:
- Пропионова ацидемия
- Метилмалонова ацидемия
- Изовалерианска ацидемия
- Изолирана 3-метил-кротонил-глицинемия
- глутарова ацидемия (тип I)
- Дефицит на митохондриална ацетоацетил-коА-тиолаза
- Хидроксиметилглутарова ацидемия
- Липса на много коА карбоксилази

III. Нарушения на окисляването на мастни киселини:
- Недостатъчен SCAD
- Липса на хидрокси-SCAD
- Липса на MCAD
- Недостатъчност на VLCAD
- Дефицит на LCAD и трифункционален дефицит на протеини
- Глутарова ацидемия тип II
- Липса на карнитин палмитоилтрансфераза II

Тандемна спектрометрия (TMS) може също да идентифицира анормални метаболити с неопределено здравословно значение. Например, SCAD дефицитът е друго разстройство на окисляването на мастните киселини, което най-често протича безсимптомно, въпреки че някои пациенти могат да имат затруднения с епизодична хипогликемия. По този начин, прогнозната стойност на анализа на положителната тандемна спектрометрия (TMS) за симптоматичен SCAD вероятно ще бъде много ниска.

Превъзхожда ли предимството на откриването sCAD недостатъци отрицателен ефект от теста, причиняващ ненужна родителска загриженост за повечето новородени, които са положителни и никога не показват клинични симптоми? По този начин не всяко заболяване, открито чрез тандемна масспектрометрия (TMS), отговаря на критериите за неонатален скрининг.

Ето защо някои експерти здравната система твърди, че на родителите и лекарите трябва да се казва само за отклонения в метаболитите с доказана клинична полза. Други се застъпват за използването на цялата информация, предоставена от тандемна масспектрометрия (TMS) и предлагат родителите и лекарите да бъдат информирани за всички анормални метаболити, независимо колко добре заболяването отговаря на стандартните критерии за неонатален скрининг. След това пациентите с аномалии с неизвестно значение могат да бъдат внимателно наблюдавани. Поради всички тези причини използването на тандемна масспектрометрия (TMS) при скрининг на новородено остава въпрос на дискусия.

За скрининг на популацията В пренаталния период обикновено се използват два теста: хромозомен анализ при възрастни жени и AFP на майката или тройна NTD и хромозомна анеуплоидия.

Ако бременност е изложен на риск поради инвазивната процедура за пренатална диагностика на хромозомна анеуплоидия поради възрастта на майката, също трябва да се предложат допълнителни тестове, например определяне на нивото на AFP в амниотичната течност, сравнителна хибридизация в целия геном за търсене на опасни субмикроскопски делеции, скрининг за мутации на муковисцидоза и други често срещани заболявания.

Какво представлява тандемната масова спектрометрия

Тандемната масова спектрометрия (TMS) е един от съвременните методи за анализ на съединения, който се използва широко за различни научни и практически цели. Този метод позволява анализ на няколко стотици съединения в микро-количества биологичен материал.

Къде се прилага този метод?

В световната здравна практика този метод се използва за провеждане на масов скрининг на новородени за наследствени метаболитни заболявания (NBD). В петна от изсъхнала кръв е възможно да се определят аминокиселини (включително фенилаланин) и ацилкарнитини. Количественото определяне на тези вещества дава възможност да се изключат няколко десетки наследствени заболявания, принадлежащи към различни класове NBO (нарушения на метаболизма на аминокиселини, органични киселини и дефекти в митохондриалното β-окисление на мастни киселини). Според данните от чуждестранната литература общата им честота е 1: 2000 живи новородени. Преди това за диагностицирането на тези нарушения се изискваше голямо количество биологичен материал, бяха необходими няколко проучвания (анализ на аминокиселини, хроматомасна спектрометрия, определяне на спектъра на ацилкарнитини), които изискваха значителни времеви и материални разходи. TMS ви позволява да определите количествено всички тези съединения в един анализ!

Какви заболявания могат да бъдат открити с помощта на този метод?

За съжаление все още не съществува един универсален, силно чувствителен и специфичен тест за диагностика на всички известни NBO, но технологиите, насочени към откриване на няколко десетки или дори стотици заболявания в един анализ, вече се превръщат в реалност. TMS също принадлежи към такива методи. Този метод дава възможност да се идентифицират с висока надеждност около 40 наследствени нарушения на метаболизма на аминокиселини, органични киселини и дефекти в митохондриалното бета-окисление на мастни киселини. Повечето от тези заболявания се появяват през неонаталния период. Списъкът с болести, които могат да бъдат диагностицирани с помощта на тази технология, е даден в раздела за анализи

Защо е необходимо да се диагностицират метаболитните заболявания възможно най-рано?

Много лекари погрешно вярват, че НБО са толкова редки, че трябва да бъдат изключени само в краен случай и много често правилната диагноза се установява на по-късна дата или заболяването изобщо не се диагностицира.

Въпреки това, вече са известни повече от 150 форми на NBO, за които са разработени методи за ефективна терапия и животът и здравето на пациента до голяма степен зависи от това колко бързо и правилно се поставя диагнозата. За 20 заболявания, които могат да бъдат диагностицирани с помощта на TMS, е разработено специално лечение. Навременна диагностика - спасен живот и здраве на пациента!

Вземане на кръвни проби

Кръвта се събира на стандартна филтърна карта (№ 903), която се използва за скрининг на новородени за PKU. Кръвта може да бъде както капилярна (от пръст, пета), така и венозна. Необходимо е да се насити добре селекцията с филтъра! Филтърната карта трябва ясно да посочва пълното име, от кого и откъде е изпратен пациентът, датата на раждане и телефонния номер на лекуващия лекар. Пробата се суши на въздух за 2-3 часа. Препоръчително е да приложите извлечение от медицинската история.