O dijagnozi nasljednih metaboličkih bolesti kod djece tandemskom spektrometrijom masa na teritoriji Sverdlovske oblasti. Savremeni problemi nauke i obrazovanja Kako pripremiti bebu za istraživanje

Tandemska masena spektrometrija jedna je od modernih metoda za analizu spojeva koja se široko koristi u razne naučne i praktične svrhe. Ova metoda omogućava analizu nekoliko stotina spojeva u mikro količinama biološkog materijala. U svjetskoj zdravstvenoj praksi ova metoda se koristi za provođenje masovnog pregleda novorođenčadi na nasljedne metaboličke bolesti (NBO). Na mjestu osušene krvi moguće je odrediti aminokiseline (uključujući fenilalanin) i acilkarnitine. Kvantitativno određivanje ovih supstanci omogućava isključivanje nekoliko desetina naslednih bolesti koje pripadaju različitim klasama NBO (poremećaji metabolizma aminokiselina, organskih kiselina i defekti u mitohondrijskoj β-oksidaciji masnih kiselina). Ranije je dijagnostika ovih poremećaja zahtijevala veliku količinu biološkog materijala, nekoliko studija (analiza aminokiselina, spektrometrija hromatomase, određivanje spektra acilkarnitina), što je zahtijevalo značajne vremenske i materijalne troškove. TMS vam omogućuje kvantificiranje svih ovih spojeva u jednom potezu! Nasljedni poremećaji metabolizma aminokiselina, organskih kiselina i defekti u mitohondrijskoj beta-oksidaciji masnih kiselina imaju oko 100 nozoloških oblika, od kojih se većina manifestuje u neonatalnom periodu. Njihova učestalost je više od 1: 5000 živorođenih. Mnogi liječnici pogrešno vjeruju da su bolesti ove skupine toliko rijetke da ih je potrebno isključiti samo u krajnjem slučaju, a vrlo često se tačna dijagnoza uspostavlja naknadno ili se bolest uopće ne dijagnosticira.

Tokom analize utvrđuju se 52 pokazatelja (aminokiseline i acilkarini)

4, 1

1 FSBI „Medicinsko-genetski istraživački centar“ Ruske akademije medicinskih nauka

2 Državna proračunska obrazovna institucija visokog profesionalnog obrazovanja "Rostovsko državno medicinsko sveučilište pri Ministarstvu zdravlja Rusije"

3 GBUZ "Regionalna klinička bolnica br. 1 nazvana po profesoru S.V. Ochapovsky", iz Odjeljenja za zdravstvo Krasnodarske teritorije

4 FSBI "Centar za medicinska genetska istraživanja"

Kako bi se potkrijepilo uvođenje masovnog pregleda novorođenčadi na nasljedne metaboličke bolesti (NBO) tandemskom masenom spektrometrijom (MS / MS), provedeno je retrospektivno istraživanje arhiviranih uzoraka krvi djece (n \u003d 86) koja su umrla u prvoj godini života. Promjene u profilima aminokiselina i acilkarnitina otkrivene su u 4 slučaja (4,7%). U jednoj od njih utvrđeno je višestruko povećanje koncentracije leucina, izolevcina i valina, što je specifično za bolest mirisa mokraće javorovog sirupa. Klinička slika i otkrivanje mutacije prvog egzona gena BCKDHB (c.98delG) u heterozigotnom stanju indirektno su potvrdili dijagnozu leucinoze. U ostala tri slučaja otkrivene promjene u profilu aminokiselina i acilkarnitina nisu istog specifičnog karaktera. U tim slučajevima bi bile potrebne ponovljene pretrage krvi MS / MS metodom, dodatne kliničke i biohemijske studije. Kao rezultat studije potvrđena je neophodnost uvođenja MS / MS metode u programe neonatalnog probira za NBO radi njihove pravovremene dijagnoze i liječenja.

retrospektivna dijagnoza

tandemska spektrometrija masa

nasledne metaboličke bolesti

1. Krasnopolskaya KD Nasljedne metaboličke bolesti. Priručnik za ljekare. - M.: RPO "Centar za socijalnu adaptaciju i rehabilitaciju djece" Fohat ", 2005. - 364 str.

2. Mikhailova SV, Zakharova E. Yu., Petrukhin AS Neurometaboličke bolesti kod djece i adolescenata. Dijagnostika i pristupi liječenju. - M.: "Literra", 2011. - 352 str.

3. Chace H. D. Brza dijagnoza MCAD nedostatka kvantitativna analiza oktanoilkarnitina i drugih acilkarnitina u novorođenim krvnim mrljama tandemskom spektrometrijom masa / Chace H. D., Hillman S. L., Van Hove J. L. et al. // Klinička hemija. - 1997. - V. 43. - br. 11. - str. 2106-2113.

4. Nyhan L. W., Barshop B. A., Ozand P. T. Atlas metaboličkih bolesti. - drugo izdanje. - London: Hodder Arnold, 2005. - 788 str.

5. Rashed M. S. Klinička primjena tandemske masene spektrometrije: deset godina dijagnoze i probira za nasljedne metaboličke bolesti // J. of Chrom. B. - 2001. - V. 758. - br. 27-48.

6. Sweetman L. Poremećaji imenovanja i brojanja (pojave) uključeni u panele za probiranje novorođenčadi / Sweetman L., Millington D. S., Therrell B. L. et al. // Pedijatrija. - 2006. - V. 117. - P. 308-314.

7. Van Hove J. L. Nedostatak acl-CoA dehidrogenaze srednjeg lanca: dijagnoza analizom acilkarnititna u krvi / Van Hove J. L., Zhang W., Kahler S. G. et al. // Am. J. Hum. Genet. - 1993. - V. 52. - P. 958-966.

Uvod

Do danas je poznato više od 500 nozoloških oblika naslednih metaboličkih bolesti (NBO). Glavnina NBO-a je izuzetno rijetka, ali njihova ukupna učestalost u populaciji je 1: 1000-1: 5000. NBO se u pravilu manifestira u prvoj godini života nespecifičnim simptomima koji ih klinički maskiraju kao drugu, nenasljednu somatsku patologiju. Istodobno je važna pravovremena dijagnoza metaboličkih nasljednih bolesti, jer su za mnoge od njih razvijene i nastavljaju se razvijati efikasne metode patogenetskog liječenja, bez kojih ishod bolesti često ostaje fatalan. Općenito je prihvaćeno da je jedan od najopravdanijih i najefikasnijih pristupa ranom otkrivanju nasljedne patologije genetski pregled novorođenčadi. Razvoj metode tandemske masene spektrometrije (MS / MS) sa jonizacijom elektrosprejom učinio je masovni spektrometrijski skrining primenljivim u praksi masovnog skrininga na NBO do kraja 90-ih godina XX veka. Ova visoko osjetljiva mikrometoda omogućuje istovremeno određivanje koncentracije desetina aminokiselina i acilkarnitina u nekoliko mikrolitara krvi, važnih za dijagnozu NBO. Učinkovitost laboratorijskog testa MS / MS omogućila je njegovo uključivanje u državne programe neonatalnog probira novorođenčadi na aminoacidopatiju, organsku aciduriju i defekte u mitohondrijskoj β-oksidaciji masnih kiselina u brojnim zemljama. Ipak, u Ruskoj Federaciji metoda MS / MS nije uvedena u sistem masovnog pregleda novorođenčadi i dostupna je za selektivni pregled NBO samo u pojedinim saveznim medicinskim centrima.

Svrha ove studije bila je znanstveno potkrijepiti potrebu za uključivanjem MS / MS studija za dijagnozu aminoacidopatija, organskih acidurija i mitohondrijskih defekata β-oksidacije masnih kiselina u regionalne programe masovnog pregleda novorođenčadi na osnovu retrospektivne masene spektrometrijske analize uzoraka krvi bolesne djece čija su bolest završila. smrtni ishod u prvoj godini života.

Pacijenti i metode istraživanja

Ova retrospektivna studija obuhvatila je djecu (n \u003d 86, omjer dječaka: djevojčice 48/38) koja su umrla u prvoj godini života (u dobi od 5 dana do 11 mjeseci života) tokom jedne kalendarske godine (2010) na administrativnoj teritoriji Krasnodarskog teritorija ... Istraživanje je obuhvatilo djecu s urođenim malformacijama (n \u003d 29), zaraznim bolestima - upalom pluća, sepsom, bakterijskim meningoencefalitisom (n \u003d 37), perinatalnim oštećenjem CNS-a (n \u003d 11), sindromom iznenadne smrti (n \u003d 6) i drugim bolestima ( n \u003d 3). Kontrolnu grupu činilo je 438 klinički zdrave novorođenčadi (227 djevojčica, 211 dječaka) u dobi od 3-8 dana. U ovoj grupi su utvrđene referentne vrijednosti koncentracija aminokiselina i acilkarnitina u kapilarnoj krvi u zdrave djece neonatalnog perioda.

Materijal za istraživanje bili su arhivirani uzorci periferne krvi na standardnim papirnatim obrascima za ispitivanje, dobiveni u 3-8 dana života za standardni neonatalni skrining. Koncentracija aminokiselina i acilkarnitina (tabela 1) u krvi određena je tandemskom masenom spektrometrijom (MS / MS) pomoću tandemskog masenog spektrometra Agilent 6410 (Agilent Technologies, SAD) prema certificiranoj metodi kompanije CHROMSYSTEM br. V1 07 05 57136 001. Studija je izvedeno u laboratoriji medicinske genetike Rostovskog državnog medicinskog instituta Ministarstva zdravlja Rusije.

Tabela 1

Metaboliti određeni MS / MS

	Metabolit	Simbol		Metabolit	Simbol
A m in k i slotovi
				3-metilkrotonilkarntin
	Asparaginska kiselina			3-hidroksiisovalerilkarnitin
	Glutaminska kiselina			Heksanoilkarnitin
	Leucin + izoleucin			Oktanoilkarnitin
	Metionin			Oktenoilkarnitin
	Fenilalanin			Dekanoilkarnitin
				Decenoilkarnitin
				Dodekanoilkarnitin
				Myristilcarnitine
	Citrulin			Tetradecenoilkarnitin
				Tetradecinoilkarnitin
				Hydroxymyristylcarntine
A ts i lkar n i t in s				Palmitoylcarnitine
	Besplatni karnitin			Hexadecenoylcarnitine
	Acetilkarnitin			Hidroksiheksadecenoilkarnitin
	Propionilkarnitin			Hidroksipalmitoilkarnitin
	Malonylcarnitine			Stearoylcarnitine
	Butyrylcartin			Oleoylcarnitine
	Metilmalonilkarnitin			Hidroksistearoilkarnitin
	Izovalerylcartin			Hidroksioleoilkarnitin
	Glutarylcarnitine			Hidroksilinoilkarnitin

Statistička obrada dobijenih podataka izvršena je pomoću programskog paketa Statistica 6.0 i proračunskih tablica Excel 2007. Za određivanje deskriptivnih numeričkih karakteristika varijabli korištene su standardne metode statističke analize: izračunavanje medijane, 0,5 i 99,5 percentila.

Za potvrdnu molekularno-genetsku dijagnozu leucinoze, DNK je izolirana iz suvih krvnih mrlja pomoću kompleta reagensa DiatomDNAPrep (Biocom LLC, Rusija). Izbor primera za PCR amplifikaciju izvršen je za 10 egzona gena BCKDHA i BCKDHB. Sekvenciranje PCR fragmenata radi otkrivanja rijetkih mutacija provedeno je prema proizvođačevom protokolu na genetskom analizatoru ABIPrism 3500 (Applied Biosystem, SAD).

Rezultati istraživanja i njihova rasprava

Kao rezultat proučavanja koncentracija aminokiselina i acilkarnitina u perifernoj krvi 438 klinički zdrave novorođenčadi, utvrđene su 0,5 i 99,5 percentilske koncentracije ispitivanih metabolita, što smo kasnije koristili kao referentne vrijednosti (Tabela 2). Usporedba koncentracija aminokiselina i acilkarnitina, utvrđenih u uzorcima krvi 86 djece koja su umrla u prvoj godini života, sa referentnim vrijednostima koncentracije, pokazala je da kod 82 pacijenta (95,3%) nijedan od ispitivanih parametara nije premašio 0,5 i 99, 5 percentila kontrolne grupe, što je omogućilo napuštanje radne verzije o prisutnosti metaboličkih poremećaja aminokiselina i karnitina, koje nisu verifikovane in vivo. Međutim, u četvero djece (4,7%) koncentracije nekih aminokiselina i acilkarnitina bile su nekoliko puta veće od gornjih granica referentnog intervala kontrolne grupe (Tabela 2).

tabela 2

Rezultati retrospektivne procjene koncentracija aminokiselina i acilkarnitina u novorođenčadi (n \u003d 4) sa nivoom pojedinačnih metabolita izvan raspona od 0,5-99,5 percentila

	Metaboliti	Koncentracije pojedinačnih metabolita (μmol / L)
		Referentne vrijednosti kontrolne grupe (n \u003d 438) u opsegu 0,5-99,5 percentila	Individualne vrijednosti pacijenta (n \u003d 4) *
			Pacijent 1	Pacijent 2	Pacijent 3	Pacijent 4
A m in k i slotovi
			2503,868
						1457,474
A ts i lkar n i t in s

* Bilješka:

Pacijent 1 - dječak KM (dijagnoza: opstruktivni bronhiolitis), umro u dobi od 11 mjeseci;

Pacijent 2 - dječak CF (dijagnoza: upala pluća), umro u dobi od 1 mjeseca;

Pacijent 3 - ženska PV (dijagnoza: sepsa), umrla je u dobi od 12 dana.

Pacijent 4 - djevojčica PA (dijagnoza: upala pluća), umrla je u dobi od 6 dana.

U prvom slučaju, kod pacijenta s CM, koji je umro u dobi od 11 mjeseci, s dijagnozom opstruktivnog bronhiolitisa, tandemska masena spektrometrija aminokiselina i acilkarnitina u arhiviranim uzorcima krvi otkrila je promjene u sadržaju leucina, izolevcina i valina, koje su po prirodi sasvim specifične da govore o velikoj vjerojatnosti urođenih metabolički defekt na putu katabolizma leucina i izolevcina. U proučavanim arhivskim uzorcima krvi utvrđeno je povećanje koncentracije leucina i izolevcina za više od 9 puta i valina za više od 3 puta u odnosu na referentne vrijednosti, što sugerira dijagnozu bolesti sa mirisom mokraće javorovog sirupa.

Iz dostupnih kliničkih podataka u korist leucinoze kod BM djeteta zabilježene su sljedeće kliničke manifestacije: rano odbacivanje dojenja, simptomi neonatalne encefalopatije, porast neuroloških simptoma - promjene u tonusu mišića, napadaji, epilepsija, usporeni psihomotorni razvoj. Dijete je često imalo ozbiljne infekcije respiratornog trakta, što je uzrokovalo obliterativni bronhiolitis, koji je bio uzrok smrti u dobi od 11 mjeseci. Nemamo podataka o tome je li dijete imalo specifičan miris mokraće, ali porast koncentracije metabolita tipičan za leucinozu i karakteristični klinički simptomi potvrđuju našu pretpostavku. Pored toga, dijagnoza bolesti mirisa mokraće od javorovog sirupa potkrepljena je rezultatima DNK dijagnoze leucinoze koristeći arhivirane uzorke krvi. Molekularno-genetska analiza otkrila je kod djeteta brisanje c.98delG u prvom eksonu gena BCKDHB u heterozigotnom stanju. Ista mutacija nalazi se i u majčinoj krvi. Zbog ograničenog broja arhiviranih uzoraka krvi djeteta i nepristupačnosti biološkog materijala njegovog oca, druga mutacija nije mogla biti otkrivena. Međutim, kombinacija kliničkih, biokemijskih i molekularno-genetičkih podataka podržava dijagnozu leucinoze (ili bolesti mirisa mokraće od javorovog sirupa, MIM ID 248600) u proučavanom slučaju.

U ostala tri slučaja otkrivene promjene u profilu aminokiselina i acilkarnitina nisu istog specifičnog karaktera kao u prethodnom slučaju. U tim je slučajevima nemoguće pretpostaviti određene NBO na osnovu podataka MS / MS, a još više sa sigurnošću tvrditi. Za diferencijalnu dijagnozu aminoacidopatija i organskih acidurija, ponovljene pretrage krvi MS / MS metodom, neophodne su dodatne kliničke i biohemijske studije.

Povećanje metabolita specifičnih za bolest je varijabilno i ovisi o mnogim faktorima. Pri tumačenju rezultata treba uzeti u obzir prehranu djeteta, uzimanje određenih lijekova. Dakle, uzimanje lijekova koji sadrže valprojsku kiselinu ili trigliceride srednjeg lanca dovodi do povećanja C6, C8 i C10, što komplikuje dijagnozu nedostatka acil-CoAdehidrogenaze srednjeg lanca. Uzimanje lijekova koji sadrže karnitin može također dovesti do povećanih koncentracija acilkarnitina kratkog i srednjeg lanca. Sadržaj dugolančanih acilkarnitina u plazmi i punoj krvi različit je, jer su povezani sa membranama eritrocita, pa hematokritski indeks ima određenu vrijednost. Uz neke izuzetke, jedno i po do dvostruko povećanje koncentracije zahtijeva drugi test krvi. Dakle, razine metabolita patognomoničnih za propionsku i izovalerijsku aciduriju obično se povećavaju više od 5 puta, a čak i neznatna promjena koncentracije glutarilkarnitina zahtijeva ne samo ponovljeni test krvi, već i dodatno istraživanje organskih kiselina u urinu karakterističnih za glutarsku aciduriju tipa I.

Zaključak

Retrospektivna studija uzoraka krvi male djece koja su umrla od različitih uzroka, provedena MS / MS metodom, sugerirala je u velikom broju slučajeva nasljednu metaboličku patologiju. U jednom od njih dijagnozu bolesti potvrdio je miris mokraće javorovog sirupa (leucinoza). Pravovremene dijagnostičke mjere u takvim su slučajevima važna komponenta u diferencijalnoj dijagnozi urođenih metaboličkih grešaka. Proučavanje koncentracije aminokiselina i acilkarnitina u uzorcima biološke tečnosti može biti od dijagnostičke vrijednosti u analizi slučajeva smrtnosti novorođenčadi. Posthumna dijagnoza nasljedne metaboličke bolesti kod preminulog djeteta indikacija je za medicinsko genetsko savjetovanje porodice. Potrebno je široko primijeniti MS / MS metodu u neonatalnom skriningu kao glavnom alatu za otkrivanje aminoacidopatija, organskih acidemija i defekata u oksidaciji β-mitohondrijskih masnih kiselina kod novorođenčadi radi pravovremene dijagnoze i liječenja NBO.

Recenzenti:

Polevichenko Elena Vladimirovna, dr. Med. Nauk, profesor, glavni istraživač Odjela za rehabilitaciju i medicinsku i socijalnu pomoć Savezne državne proračunske institucije "Savezni istraživački centar za dječju hematologiju, onkologiju i imunologiju imena Dmitrija Rogačova", Ministarstva zdravlja Rusije, Moskva.

Mikhailova Svetlana Vitalievna, dr. Med. Nauk, šef Odeljenja za medicinsku genetiku, Ruska dečja klinička bolnica, Ministarstvo zdravlja Rusije, Moskva.

Bibliografska referenca

Baydakova G.V., Antonets A.V., Golikhina T.A., Matulevich S.A., Amelina S.S., Kutsev S.I., Kutsev S.I. RETROSPEKTIVNA DIJAGNOZA NASLJEDNIH BOLESTI RAZMJENJIVAČKE METODE TANDEMSKE MASNE SPEKTROMETRIJE // Suvremeni problemi znanosti i obrazovanja. - 2013. - br. 2;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id\u003d8953 (datum pristupa: 12.12.2019). Skrećemo vam pažnju časopisima koje je izdala "Akademija prirodnih nauka"

Prema pregledu objavljenom u Clinical Biochemist Reviews, upotreba tečne hromatografije visokih performansi u kombinaciji sa tandemskom spektrometrijom masa (HPLC-MS / MS) u kliničkim laboratorijama izuzetno je porasla tokom poslednjih 10-12 godina. Autori napominju da je specifičnost HPLC-MS / MS analize znatno superiornija od imunoloških metoda i klasične tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) u analizi molekula male molekulske mase i ima znatno veće performanse od gasne hromatografije-masene spektrometrije (GC-MS). Popularnost ove metode u rutinskim kliničkim analizama trenutno se objašnjava jedinstvenim mogućnostima metode.

Glavne prednosti HPLC-MS / MS metode su:
• Tačna kvantitativna analiza malih molekula;
• Simultana analiza više ciljanih jedinjenja;
• Jedinstvena specifičnost;
• Velika brzina analize.

Posljednjih godina velika pažnja posvećena je vremenu analize i, kao rezultat, povećanju laboratorijske produktivnosti. Značajno smanjenje vremena analize omogućeno je upotrebom kratkih analitičkih stupaca za HPLC / MS / MS, uz istovremeno dramatično povećanje specifičnosti analize. Upotreba jonizacije atmosferskog pritiska (API), tandemski trostruki kvadrupolni maseni spektrometar i napredna tečna hromatografija visokih performansi, kao i srodne tehnike pripreme uzoraka, stavili su HPLC-MS / MS u prvi plan modernih analitičkih metoda za klinička istraživanja.

Glavne primjene HPLC / MS / MS u kliničkoj medicini su:
• Dobivanje kompletnog profila metabolizma steroida (steroidnih ploča), purina i pirimidina i drugih jedinjenja,
  skrining novorođenčadi na urođene metaboličke greške (otkrivanje nekoliko desetina bolesti u jednoj analizi);
• Terapijsko praćenje medicinskih proizvoda - imunosupresiva, periokonvulziva, antiretrovirusa, antikoagulansa i bilo kojih drugih - bez obzira na dostupnost kompleta proizvođača. Za svaku supstancu nije potrebno kupovati skupe komplete - možete razviti vlastite metode;
• Klinička toksikologija - analiza više od 500 opojnih jedinjenja i njihovih metabolita u jednoj analizi, bez potvrdne analize
  proteomika i metabolomika.

Pored toga, HPLC-MSMS se koristi za skrining oligosaharida urina, sulfatida, masnih kiselina dugog lanca, žučnih kiselina dugog lanca, metilmalonske kiseline, studija porfirije, skrininga pacijenata s oštećenim metabolizmom purina i pirimidina.

Primjeri primjene za tečnu hromatografiju
u kombinaciji sa tandemskom spektrometrijom masa u kliničkim analizama.

Probir novorođenčadi: Prvi primjer masovne upotrebe HPLC-MS / MS u kliničkoj dijagnostici bio je pregled urođenih metaboličkih grešaka kod novorođenčadi. Trenutno je to u razvijenim zemljama rutinska metoda i pokriva više od 30 različitih bolesti, uključujući acedemiju, aminoacidopatije i oštećenja oksidacije masnih kiselina. Posebno treba napomenuti istraživanje urođenih mana, koje mogu dovesti do ozbiljnih problema ukoliko se ne poduzmu hitne mjere (npr. Uvećano srce ili jetra ili moždani edem). Prednost upotrebe HPLC-MS / MS za skrining novorođenčadi je mogućnost istovremenog analiziranja svih aminokiselina i acilkarnitina brzom, jeftinom i visoko specifičnom metodom.

Terapijsko praćenje lijekova: Razvoj i uvođenje imunosupresiva sirolimusa (rapamicina) za prevenciju odbacivanja organa nakon transplantacije jedan je od glavnih poticaja za uvođenje HPLC-MS / MS u kliničke laboratorije. Savremena HPLC-MS / MS metoda omogućava istovremeno određivanje takrolimusa, sirolimusa, ciklosporina, everolimusa i mikofenske kiseline.

HPLC-MS / MS se koristi i za analizu citotoksičnih, antiretrovirusnih lijekova, tricikličnih antidepresiva, antikonvulziva i drugih lijekova koji zahtijevaju pojedinačne doze.

HPLC-MSMS metoda omogućava razdvajanje i kvantifikaciju R- i S-enantiomera varfarina u rasponu koncentracija od 0,1-500 ng / ml.

Narkotični i ublaživači bolova: HPLC-MS / MS se široko koristi za analizu ovih jedinjenja zbog jednostavnosti pripreme uzorka i kratkog vremena analize. Metoda se trenutno koristi u kliničkim laboratorijama za provjeru prisutnosti širokog spektra lijekova. Jedinstvena specifičnost i osjetljivost metode omogućavaju istovremenu analizu više od 500 spojeva različitih klasa u jednom uzorku uz minimalnu pripremu uzorka. Dakle, u slučaju analize urina dovoljno je jednostavno razrjeđivanje uzorka 50-100 puta. Kada se analizira kosa, umjesto snopa od 100-200 dlaka, dovoljna je jedna dlaka da se pouzdano utvrde činjenice upotrebe droge.

Endokrinologija i analiza steroida: HPLC-MS / MS se široko koristi u mnogim endokrinološkim laboratorijama za analizu steroida - testosterona, kortizola, aldesterona, progesterona, estriola i mnogih drugih.

Sve više laboratorija počinje koristiti HPLC-MS / MS za određivanje nivoa vitamina D3 i D2 u krvi.

I. Definicija steroida (steroidni profil).

Bolničke i kliničke laboratorije sada mogu provoditi HPLC / MS / MS istovremeno određivanje višestrukih steroida. Istovremeno, nije potrebna velika količina uzorka, što je posebno važno kada se analiziraju dječji uzorci.

Slučajevi u kojima je poželjno odrediti nekoliko (profilirajućih) steroida:
• Kongenitalna nadbubrežna hiperplazija (CAH) urođeni je defekt u biosintezi steroida. To je nasljedna skupina bolesti uzrokovanih nepravilnom aktivnošću enzima kore nadbubrežne žlijezde, što dovodi do smanjenja proizvodnje kortizola. Za pouzdanu dijagnozu SAN preporuča se utvrđivanje kortizola, androstenediona i 17-hidroksiprogesterona. HPLC / MS / MS omogućava tačnu kvantifikaciju sva tri steroida u jednom pokušaju sa 100% pouzdanosti.
• Rutinski skrining novorođenčadi pomoću imunoloških testova karakterizira visoka stopa lonopozitivnih i lažno negativnih rezultata. HPLC / MS / MS određivanje ne samo kortizola, već i aldosterona i 11-deoksikortizola, omogućava razlikovanje primarne od sekundarne insuficijencije kore nadbubrežne žlijezde.
• HPLC / MS / MS omogućava određivanje steroida kod prostatitisa i sindroma hroničnog bola u karlici.
• HPLC-MS / MS omogućava profiliranje steroida i identifikaciju uzroka prevremenog puberteta povezanog sa nadbubrežnom žlijezdom kod male djece. Utvrđeno je da su koncentracije testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) i njegovog sulfata u ove djece bile nešto veće nego u starije djece u kontrolnoj skupini.
• U serumu aktivnih pušača, pasivnih pušača i nepušača analizira se prisustvo 15 steroidnih hormona i hormona štitnjače kako bi se istražila veza između pacijenata izloženih dimu i koncentraciji hormona.
• HPLC / MS / MS koristi se za profiliranje određenih ženskih steroidnih hormona u urinu.
• Korištenjem HPLC / MS / MS procijenjene su koncentracije neuroaktivnih hormona kako bi se spriječila dijabetička neuropatija.

II. Određivanje tiroidnih hormona

Rutinske metode određivanja hormona štitnjače obično se temelje na radioimunološkim testovima, koji su skupi i mjere samo T3 i T4, što može ograničiti sposobnost određivanja i potpune regulacije funkcije štitnjače.

• Trenutno se, kada se koristi HPLC-MSMS, u uzorcima krvnog seruma istovremeno analizira pet hormona štitnjače, uključujući tiroksin (T4), 3,3 ', 5-trijodotironin (T3), 3,3', 5'- (rT3), 3 , 3'-dijodotironin (3,3'-T2) i 3,5-dijodotironin (3,5-T2) u rasponu koncentracija 1-500 ng / ml.
• HPLC / MS / MS metoda se takođe koristi za analizu hormonskog sastava pacijenata koji su podvrgnuti tireoidektomiji. Određuju se koncentracije tiroksina (T4), trijodotironina (T3), slobodnog T4 i stimulirajućeg hormona štitnjače (TSH) nakon operacije. Utvrđeno je da je HPLC / MS / MS izvrstan način uspostavljanja veze između koncentracije TSH i koncentracije hormona štitnjače.
• HPLC / MS / MS metoda korištena je za određivanje tiroksina (T4) u ljudskoj pljuvački i serumu. Metodu karakterizira visoka ponovljivost, tačnost i granica detekcije od 25 pkg / ml. Studije su pokazale da postoji dijagnostička veza u koncentraciji T4 u pljuvačkoj između ispitanika koji imaju eutireozu i pacijenata s Gravesovom bolešću.

HPLC / MS / MS metoda sada ima osjetljivost, specifičnost i tačnost potrebne za pouzdano određivanje svih steroida u biološkim tečnostima i na taj način poboljšava dijagnostičke mogućnosti, posebno u slučaju steroidnih kompleta.

III. Određivanje 25-oksivitamina D pomoću HPLC / MS / MS

25-hidroksi vitamin D (25OD) glavni je oblik vitamina D u cirkulaciji i preteča njegovog aktivnog oblika. (1,25-dioksivitamin D). Zbog svog dugog poluvijeka, određivanje 25OD važno je za određivanje statusa vitamina D u tijelu pacijenta. Vitamin D postoji u dva oblika: vitamin D3 (holekalciferol) i vitamin D2 (ergokalciferol). Oba oblika se metaboliziraju u odgovarajuće 25OD forme. Za dijagnostiku je od velike važnosti dostupnost analitičkih metoda koje mogu s velikom preciznošću odrediti oba oblika vitamina i omogućiti praćenje bolesnika s poremećajima u sadržaju vitamina D. Do sada korištene metode nisu omogućavale odvojeno određivanje vitamina D2 i D3. Uz to, pri visokim koncentracijama vitamina D2 podcjenjiva je količina D3 koja se može otkriti. Još jedan nedostatak je upotreba radioaktivnih izotopa. Upotreba HPLC / MS / MS metode omogućila je ne samo izbjegavanje upotrebe radioaktivnih izotopa, već i zasebno određivanje oba aktivna oblika vitamina.

Metoda je primjenjiva za sljedeće pacijente:
1. Ako sumnjate na nizak sadržaj vitamina D u tijelu;
2. Ako sumnjate na neobjašnjivi toksični efekat;
3. Prilikom pregleda pacijenata na liječenju zbog niskog sadržaja vitamina D;
4. Upotreba HPLC / MS / MS omogućila je odvojeno određivanje oba oblika u praćenju pacijenta.

IV. Određivanje imunosupresiva pomoću HPLC / MS / MS

Nakon transplantacije organa, cijelog života morate uzimati imunosupresore kako biste izbjegli odbacivanje. Uz vrlo uski terapijski opseg i visoku toksičnost, imunosupresivi zahtijevaju pojedinačne doze kako bi maksimizirali svoj učinak. Stoga je vitalno nadzirati glavne imunosupresore: ciklosporin A, takrolimus, sirolimus i everolimus kako bi se prilagodila doza lijeka za svakog pojedinačnog pacijenta, ovisno o koncentraciji lijeka u krvi.

Imunotest se i dalje koristi za praćenje navedenih lijekova, ali ove metode su skupe i njihova specifičnost, tačnost i ponovljivost su ograničeni. Poznati su slučajevi smrti pacijenata od pogrešne doze imunosupresiva, na osnovu rezultata dobijenih imunološkim metodama. Trenutno se imunotestovi u kliničkim laboratorijama zamjenjuju HPLC / MS / MS. Tako se na klinici Univerziteta u Minhenu dnevno analizira oko 70 uzoraka na sadržaj sirolimusa i ciklosporina A pomoću HPLC / MS / MS sistema. Sve pripreme uzoraka i kontrolu instrumenata vrši jedna osoba. Laboratorija takođe prelazi na analizu takrolimusa ovom metodom.

• Opisana je upotreba HPLC / MS / MS za rutinsko simultano određivanje takrolimusa, sirolimusa, askomicina, demetiksisirolimusa, ciklosporina A i ciklosporina G u krvi. Raspon određen koncentracijom je 1,0 - 80,0 ng / ml. Za ciklosporin 25 - 2000 ng / ml. Tokom godine laboratorij je analizirao više od 50.000 uzoraka.
• Budući da je utvrđeno da istovremena primjena takrolimusa i sirolimusa daje pozitivan terapeutski učinak, razvijena je jednostavna i učinkovita HPLC / MS / MS metoda za njihovo odvojeno određivanje u krvi za kliničke analize. Analiza jednog uzorka traje 2,5 minuta s tačnošću od 2,46% - 7,04% za takrolimus i 5,22% - 8,30% za sirolimus za cijelu analitičku krivulju. Donja granica detekcije za takrolimus je 0,52 ng / ml, za sirolimus - 0,47 ng / ml.

V. Određivanje homocisteina pomoću HPLC / MS / MS

Homocistein je zanimljiv za kardiovaskularne bolesti (tromboembolija, bolesti srca, ateroskleroza) i druga klinička stanja (depresija, Alzheimerova bolest, osteoporoza, komplikacije u trudnoći itd.). Postojeće metode za analizu homocisteina, uključujući imunološke testove, su skupe. Razvijena je brza HPLC / MS / MS metoda za analizu homocisteina za rutinsku kliničku upotrebu pri analizi velikog broja uzoraka. Ionizacija je izvršena metodom elektrosprej. Metoda je ponovljiva, visoko specifična i precizna. Prednosti metode su također niska cijena reagenasa i jednostavnost pripreme uzorka. Moguće je analizirati 500 ili više uzoraka dnevno.

Zaključak

Treba napomenuti da, iako se trenutno koriste značajno poboljšane metode imunološkog ispitivanja, zbog tehničkih temeljnih ograničenja, ova metoda nikada neće imati tačnost i specifičnost za ciljnu supstancu uporedivu sa HPLC-MSMS, posebno u prisustvu metabolita. To ne dovodi samo do niske preciznosti ELISA metode i visokog postotka lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata, već također ne omogućuje usporedbu rezultata dobivenih na različitim kliničkim odjelima ELISA metodom. Upotreba HPLC-MS / MS uklanja ovaj nedostatak, omogućava visoko specifičnu, tačnu i brzu analizu velikog broja uzoraka s velikom pouzdanošću u prisustvu metabolita i odsustvom smetnji istovremenih i endogenih supstanci u plazmi i krvi pacijenata.

Uprkos naizgled skupim troškovima kompleta instrumenata, kako pokazuje svjetska praksa, pravilnim radom ovaj kompleks se isplati za 1-2 godine. To je prije svega zbog niske cijene po analizi zbog istovremene analize na desetke i stotine spojeva i odsustva potrebe za kupnjom skupih dijagnostičkih kompleta. Pored toga, laboratorij ima priliku samostalno razviti sve potrebne metode analize i ne ovisiti o proizvođaču kompleta.

Odabir ispravne konfiguracije kompleta instrumenata

Postoji veliki broj različitih metoda masene spektrometrije i tipova masenih spektrometara dizajniranih za rješavanje širokog spektra problema - od strukturne identifikacije složenih makromolekula proteina težine stotine hiljada daltona do rutinske visokokvalitetne kvantitativne analize malih molekula.

Za uspješno rješenje zadatka jedan od glavnih uvjeta je odabir odgovarajuće vrste opreme. Ne postoji jedinstveni instrument za rješavanje čitavog spektra analitičkih zadataka. Dakle, uređaj dizajniran za rješavanje problema identifikacije mikroorganizama nije sposoban za kvantitativnu analizu malih molekula. I obrnuto. Činjenica je da su to, uprkos zajedničkom imenu, potpuno različiti uređaji koji rade na različitim fizičkim principima. U prvom slučaju to je masni spektrometar vremena leta sa laserskim izvorom jonizacije - MALDI-TOF, a u drugom - trostruki kvadrupol sa jonizacijom elektrosprejom - HPLC-MSMS.

Drugi najvažniji parametar je odabir ispravne konfiguracije sistema. Postoji nekoliko glavnih proizvođača opreme za masenu spektrometriju. Uređaji svakog proizvođača imaju ne samo vlastite snage, već i slabosti, o kojima obično radije šute. Svaki proizvođač proizvodi svoju liniju uređaja. Troškovi jednog analitičkog kompleksa kreću se od 100.000 do 1.000.000 ili više dolara. Izbor optimalnog proizvođača i ispravna konfiguracija opreme ne samo da će uštedjeti značajna financijska sredstva, već i učinkovitije riješiti problem. Nažalost, postoji mnogo primjera kada je laboratorijska oprema izrađena bez uzimanja ovih faktora u obzir. Rezultat je neaktivna oprema, bačen novac.

Treći faktor uspjeha laboratorije je osoblje. Maseni spektrometri zahtijevaju visoko kvalificirano osoblje. Nažalost, ni jedan ruski univerzitet nema kurs moderne praktične masene spektrometrije, posebno u odnosu na kliničke primjene, a zadaci obuke osoblja svake laboratorije moraju se rješavati samostalno. Naravno, 2-3 dana obuke za upoznavanje koju je proizvođač vodio nakon pokretanja opreme apsolutno nisu dovoljni za razumijevanje osnova metode i stjecanje vještina za rad s uređajem.

Četvrti faktor je nedostatak gotovih metoda analize. Svaka laboratorija ima svoje prioritetne zadatke, za čije je rješenje potrebno razviti vlastite metode. To može učiniti osoba koja ima najmanje 2-3 godine iskustva s uređajem. Proizvođači ponekad daju jednu ili dvije opće smjernice preporučljive prirode, ali ih ne prilagođavaju određenim laboratorijskim zadacima.

IN LLC "BioPharmExpert" stručnjaci sa dugogodišnjim iskustvom rade na raznim vrstama masenih spektrometara, kao i na razvoju metoda i formulaciji analiza visokih performansi. Stoga pružamo sljedeće usluge:

1. Izbor optimalne konfiguracije uređaja za određene klijentske zadatke.
2. Kupovina, isporuka i lansiranje opreme od vodećih proizvođača tandemskih masenih spektrometara.Postepena obuka osoblja u roku od godinu dana od datuma lansiranja opreme.
3. Skup gotovih metoda i baza podataka za rješavanje osnovnih kliničkih problema.
4. Razvoj metoda analize i rješavanje specifičnih problema klijenta u njegovoj laboratoriji uz uključivanje njegovog osoblja.
5. Metodološka podrška u svim fazama rada.

Dugo godina se uglavnom provodi skrining testovispecifične za svaku pojedinačnu bolest. Na primjer, PKU pregled zasnovan je na mikrobiološkoj ili hemijskoj procjeni povećanja fenilalanina.

Ova se situacija u prošlosti potpuno promijenila decenija pojavom tehnologije tandemske masene spektrometrije (TMS). Analiza tandemske masene spektrometrije (TMS) može ne samo precizno i \u200b\u200bbrzo otkriti povišeni fenilalanin u krvnoj mrlji novorođenčeta s manje lažno pozitivnih rezultata u odnosu na starije metode, već i istovremeno otkriti nekoliko desetaka drugih biokemijskih abnormalnosti.

Neki od njih su već prikazani pojedinačni testovi... Na primjer, mnoge države su koristile specifične testove za otkrivanje povišenja metionina za otkrivanje tandemske masene spektrometrije (TMS) također se pokazalo pouzdanom metodom za nenatalni skrining nekih bolesti koje udovoljavaju kriterijima skrininga, ali im nedostaje prethodno pouzdan test.

Na primjer, insuficijencija MCAD - bolest oksidacije masnih kiselina, obično asimptomatska, ali klinički prepoznatljiva kada pacijent poveća katabolizam. Otkrivanje nedostatka MCAD pri rođenju može biti od vitalne važnosti jer bolesna djeca imaju vrlo visok rizik od po život opasne hipoglikemije u ranom djetinjstvu u kataboličkim uvjetima uzrokovanim interkurentnim bolestima kao što je virusna infekcija.

Gotovo četvrtina djece sa nedijagnosticirani nedostatak MCAD umri u prvoj epizodi. Pravilnim liječenjem metabolički poremećaj može se poništiti. Ako je MCAD nedovoljan, primarni cilj skrininga je upozoriti roditelje i liječnike na rizik od metaboličke dekompenzacije, jer su djeca praktički zdrava između napada i ne trebaju svakodnevno liječenje, osim da bi se isključilo dugotrajno postu.

I dalje koristi tandemska masena spektrometrija (TMS) za neonatalni skrining i dalje ostaje upitan. Pored brzog testiranja mnogih poremećaja za koje se neonatalni skrining već radi ili bi mogao biti opravdan, tandemska masena spektrometrija (TMS) otkriva i novorođenčad s urođenim metaboličkim greškama kao što je metilmalonska acidemija, koja obično nisu uključena u programe skrininga zbog rijetkosti i poteškoća u pružanju usluga definitivna terapija koja štiti od progresivnog neurološkog pogoršanja.

Bolesti otkrivene tandemskom spektrometrijom masa

I. Aminoacidemije:
- PKU
- bolest mokraće s mirisom javorovog sirupa
- Homocistinurija
- Citrulinemija
- Arginin amber aciduria
- tirozinemija tip I

II. Organska acidemija:
- Propionska acidemija
- Metilmalonska kiselina
- Izovalerijska acidemija
- Izolovana 3-metil-krotonil-glicinemija
- glutaricna kiselina (tip I)
- Nedostatak mitohondrijske acetoacetil-coA-tiolaze
- Hidroksimetilglutarna kiselina
- Nedostatak mnogih coA karboksilaza

III. Poremećaji oksidacije masnih kiselina:
- Nedovoljan SCAD
- Nedostatak hidroksi-SCAD
- Nedostatak MCAD-a
- Nedovoljnost VLCAD-a
- LCAD nedostatak i trifunkcionalni nedostatak proteina
- Glutarna acidemija tip II
- Nedostatak karnitin palmitoiltransferaze II

Tandemska masena spektrometrija (TMS) takođe mogu identifikovati abnormalne metabolite neodređenog zdravstvenog značaja. Na primjer, nedostatak SCAD-a je još jedan poremećaj oksidacije masnih kiselina koji je najčešće asimptomatski, iako neki pacijenti mogu imati poteškoća s epizodnom hipoglikemijom. Dakle, predviđajuća vrijednost pozitivne tandemske masene spektrometrije (TMS) za simptomatski SCAD vjerojatno će biti vrlo niska.

Da li prednost detekcije premašuje sCAD nedostaci negativan efekat testa koji uzrokuje neprimjerenu zabrinutost roditelja kod većine novorođenčadi koja imaju pozitivan test i nikada ne pokazuju kliničke simptome? Dakle, ne zadovoljava svaka bolest otkrivena tandemskom spektrometrijom masa (TMS) kriterije za neonatalni skrining.

Zbog toga neki stručnjaci zdravstveni sistem tvrdi da bi roditeljima i ljekarima trebalo reći samo o abnormalnostima u metabolitima s dokazanom kliničkom koristi. Drugi se zalažu za upotrebu svih podataka pruženih tandemskom spektrometrijom masa (TMS) i predlažu da se roditelji i ljekari informiraju o svim abnormalnim metabolitima, bez obzira na to koliko dobro bolest ispunjava standardne kriterije za neonatalni skrining. Tada se mogu pažljivo pratiti pacijenti sa anomalijama nepoznatog značaja. Iz svih ovih razloga, upotreba tandemske masene spektrometrije (TMS) u skriningu novorođenčadi ostaje predmet rasprave.

Za skrining stanovništva U prenatalnom periodu obično se koriste dva testa: analiza hromozoma u starijih žena i AFP majčinog seruma ili trostruka NTD i hromozomska aneuploidija.

Ako a trudnoća je pod rizikom zbog invazivnog postupka prenatalne dijagnoze hromozomske aneuploidije zbog starosti majke, treba ponuditi i dodatna ispitivanja, na primjer, određivanje nivoa AFP u plodnoj vodi, komparativnu hibridizaciju u čitavom genomu u potrazi za opasnim submikroskopskim delecijama, probir na mutacije cistične fibroze i drugih čestih bolesti.

Što je tandemska masena spektrometrija

Tandemska masena spektrometrija (TMS) jedna je od modernih metoda za analizu spojeva koja se široko koristi u razne naučne i praktične svrhe. Ova metoda omogućava analizu nekoliko stotina spojeva u mikro količinama biološkog materijala.

Gdje se primjenjuje ova metoda?

U svjetskoj zdravstvenoj praksi, ova metoda se koristi za provođenje masovnog pregleda novorođenčadi na nasljedne metaboličke bolesti (NBD). Na mjestu osušene krvi moguće je odrediti aminokiseline (uključujući fenilalanin) i acilkarnitine. Kvantitativno određivanje ovih supstanci omogućava isključivanje nekoliko desetina naslednih bolesti koje pripadaju različitim klasama NBO (poremećaji metabolizma aminokiselina, organskih kiselina i defekti u mitohondrijskoj β-oksidaciji masnih kiselina). Prema podacima iz strane literature, njihova ukupna učestalost je 1: 2000 žive novorođenčadi. Prije je dijagnoza ovih poremećaja zahtijevala veliku količinu biološkog materijala, nekoliko studija (analiza aminokiselina, spektrometrija hromatomase, određivanje spektra acilkarnitina), što je zahtijevalo značajne vremenske i materijalne troškove. TMS vam omogućuje kvantificiranje svih ovih spojeva u jednom pokušaju!

Koje se bolesti mogu otkriti ovom metodom?

Nažalost, još uvijek ne postoji jedan univerzalni, visoko osjetljivi i specifični test za dijagnozu svih poznatih NBO-a, ali tehnologije usmjerene na otkrivanje nekoliko desetaka ili čak stotina bolesti u jednoj analizi već postaju stvarnost. TMS također pripada takvim metodama. Ova metoda omogućava s velikom pouzdanošću identificirati oko 40 nasljednih poremećaja metabolizma aminokiselina, organskih kiselina i defekata u mitohondrijskoj beta-oksidaciji masnih kiselina. Većina ovih bolesti javlja se tokom neonatalnog perioda. Spisak bolesti koje se mogu dijagnosticirati pomoću ove tehnologije dat je u odjeljku za analize

Zašto je potrebno što ranije dijagnosticirati metaboličke bolesti?

Mnogi doktori pogrešno vjeruju da su NBO toliko rijetki da ih treba isključiti samo u krajnjem slučaju, a vrlo često se tačna dijagnoza uspostavlja naknadno ili se bolest uopće ne dijagnosticira.

Međutim, već je poznato više od 150 oblika NBO za koje su razvijene metode efikasne terapije, a život i zdravlje pacijenta u velikoj mjeri ovise o tome koliko brzo i pravilno se postavlja dijagnoza. Za 20 bolesti koje se mogu dijagnosticirati pomoću TMS-a razvijen je poseban tretman. Pravovremena dijagnoza - spasili život i zdravlje pacijenta!

Uzimanje uzoraka krvi

Krv se sakuplja na standardnoj filter kartici (br. 903), koja se koristi za pregled novorođenčadi na PKU. Krv može biti i kapilarna (iz prsta, pete) i venska. Izbor je potrebno dobro zasititi filterom! Kartica filtera mora jasno naznačiti puno ime, ime i prezime, odakle je pacijent poslan, datum rođenja i telefonski broj ljekara. Uzorak se suši na zraku 2-3 sata. Preporučljivo je priložiti izvod iz povijesti bolesti.