Golovna Gejala Cara melakukan diagnostik PCR Analisis menggunakan metode PCR. Sensitivitas penyelidikan yang tinggi

Cara melakukan diagnostik PCR Analisis menggunakan metode PCR. Sensitivitas penyelidikan yang tinggi

PLR (reaksi Lanzug polimerase) merupakan pencapaian biologi molekuler, salah satu metode utama diagnostik laboratorium klinis di akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21, yang membawa kerugian besar bagi berbagai pasien ilmu kedokteran.

Sedemikian rupa, di tengah jutaan sel tubuh manusia, yang dimusnahkan bukanlah virus hidup itu sendiri, tetapi hanya sebagian DNA-nya, maka PLR, karena tidak dapat diganggu, mungkin akan mencoba. untuk menghindari tugas dan menginformasikan tentang kehadiran "alien" "hasil yang positif. Inti dari PLR adalah keunggulan utamanya.

Hidrasi dan kekurangannya

Laboratorium yang melakukan diagnosa PLR sangat membutuhkan ketersediaan sistem pengujian dan kualifikasi tenaga medis. Ini adalah laboratorium berteknologi tinggi yang memiliki gudang reagen yang sangat sensitif dan sangat spesifik, sehingga tidak ada kekurangan khusus. Apa pun yang menunjukkan hasil positif tanpa adanya manifestasi klinis sehingga menempatkan dokter pada dilema: haruskah kita memulai pengobatan atau tidak?

Dokter yang merawat pasien mulai meragukan keandalan hasil tes, asalkan tidak ada tanda-tanda penyakit. Namun, sensitivitas tinggi dari sistem PLR didasarkan pada ingatan yang mengungkapkan peringatan pada tahap pra-klinis, dan hasil positif dalam kasus ini terjadi dalam waktu lebih cepat dari satu tahun, bukan dalam jangka panjang. Berdasarkan hal ini, dokter bertanggung jawab untuk membuat keputusan sendiri tentang kegunaan terapi, dengan mempertimbangkan argumen “mendukung” dan “menentang” lainnya.

Keuntungan diagnosis menggunakan reaksi polimerase Lanziug sudah jelas:

Spesifisitas tinggi, yang mencapai 100%, disebabkan oleh adanya partikel asam nukleat dalam sampel yang kuat pada organisme tertentu, atau asing bagi manusia;
Produktivitas tinggi, dan bahkan PLR adalah teknik otomatis berteknologi tinggi yang memungkinkan dilakukannya pengujian pada hari pengumpulan materi dan secara rutin merawat pasien jika terjadi kecemasan;
PLR, yang mengerjakan satu kerusakan, dapat melakukan serangkaian investigasi mengungkapkan sejumlah hari libur seolah-olah dia akan menjadi harta karun. Misalnya, ketika mendiagnosis infeksi klamidia, ketika PLR diterapkan pada metode utama, untuk klamidia, seseorang dapat mendeteksi Neisser (gonococcus) - seorang yang mengkhawatirkan. Selain itu, tidak ada dampak negatif terhadap keandalan hasil;
Pengujian menggunakan metode PLR mengungkapkan mikroorganisme yang tidak aman selama masa inkubasi Jika penyakitnya belum mencapai akhir tubuh, maka diagnosis dini mengantisipasi perkembangan proses patologis di masa depan, yang memungkinkan kita mempersiapkan sesuatu yang baru dan menerimanya secara keseluruhan.

Selain itu, untuk menghilangkan kebingungan yang kadang-kadang timbul selama diagnosis, PLR melindungi dirinya dengan fakta bahwa hasilnya dapat direkam (fotografi, komputer) dengan menggunakan metode vicorisasi pada ahli untuk tujuan yang mungkin diperlukan.

Norma dalam tipe PLR adalah menghargai hasil negatif, yang menunjukkan adanya pecahan asam nukleat asing, bukti positif menunjukkan adanya infeksi di dalam tubuh, nilai digital menunjukkan kekuatan virus dan konsentrasinya pada saat pengujian. Proteo secara eksternal menguraikan analisis dokter ini, yang telah melakukan studi khusus tentang topik “PLR”. Tidak ada gunanya mencoba menafsirkan hasilnya sendiri, karena segera setelah semuanya terjadi, Anda bisa salah paham dan mulai menyombongkan diri.

Apa yang ditakutkan oleh PLR, apa yang dapat dilakukannya, dan bagaimana kita mempersiapkannya?

Seperti investigasi lainnya, Terkadang hasil tesnya positif atau negatif, de PLR tidak bisa disalahkan. Hal berikut mungkin terjadi dalam situasi seperti ini:

Terganggunya proses teknologi pada salah satu tahapan reaksi;
Aturan Nedotrimannya untuk pengumpulan bahan, konservasi dan pengangkutannya;
Kehadiran unsur pihak ketiga dalam materi.

Artinya, sebelum PLR mendiagnosis infeksi, perlu dilakukan pendekatan dengan penuh hormat, hati-hati dan akurat, jika tidak, bahan tersebut dapat mengubah strukturnya atau runtuh sepenuhnya.

Tahapan diagnostik PLR. Hasil Milkov mungkin terganggu pada setiap tahap penyelidikan.

Diagnosis infeksi dengan PLR termasuk dalam kategori “standar emas” di antara metode laboratorium lainnya, sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi penyakit sehari-hari orang kaya, yang pada pandangan pertama tidak menunjukkan sesuatu yang signifikan.

TBC di berbagai lokalisasi, pneumonia (termasuk pneumonia atipikal yang disebabkan oleh klamidia);
Infeksi pada masa kanak-kanak (rubella sapi, gondongan, kicauan);
Difteri;
Salmonella;
Penyakit menular zoonosis - listeriosis (penyakit ini ditandai dengan berbagai gejala akibat kerusakan kelenjar getah bening, sistem saraf pusat, organ dalam);
Penyakit yang disebabkan oleh virus Epstein-Barr (mononukleosis menular, dll.);
Patologi onkologis, dipicu oleh infeksi papilomavirus (IDP jenis ini);
Boreliosis (penyakit Lyme, ensefalitis tick-borne);
Infeksi Helicobacter pylori, disebabkan oleh mikroba Helicobacter pylori yang hidup di vulva seseorang. Helicobacter pylori telah terbukti menyebabkan perkembangan kanker skutum atau usus besar 12 digit;
dan praktis semuanya.

Diagnosis PLR dari infeksi yang ditularkan oleh suatu negara sangat penting ketika bagian-bagian penyakit, yang berteriak dengan cara ini, sering kali melewati masa-masa sulit tanpa manifestasi klinis apa pun, kemudian, ketika tingkat keparahannya dimulai, aktivitasnya dimulai. , sedemikian rupa, mengancam kesehatan dan menghancurkan kehidupan anak . Gunakan saya dengan cara yang sama. Tindakan mereka (“obor”) segera ditetapkan dan sampai dengan ІПШ, sisanya memerlukan pertimbangan laporan. Anda dapat mempelajari lebih lanjut tentang metode paling populer di bagian artikel berikut.

Bagaimana cara mempersiapkannya dengan benar untuk mendapatkan hasil yang dapat diandalkan?

Penting untuk dicatat bahwa persiapan PLR sederhana dan tidak memerlukan usaha khusus dari pasien. Penting untuk menandatangani tiga tugas canggung:

Jangan mengacu pada artikel 24 tahun sebelum tanggal analisis;
Untuk mengambil dan menganalisis darah dari vena, Anda harus datang ke kapal cepat, tetapi Anda tidak boleh minum sampai Anda berbicara;
Berikan kepada saya secepatnya (dalam toples steril, taruh di depan apotek).

PLR dapat dilakukan di lingkungan biologis apa pun

Metode PLR tidak mengganggu “haus darah”, melainkan menggunakan media biologis untuk mencegah penularan agen infeksi. pilih – apa yang perlu diambil untuk pemeriksaan lebih lanjut akan dikirim ke dokter.

Dengan cara ini, untuk mencari alarm, selain analisis darah (walaupun kita juga dapat mendekati dan, dalam banyak kasus, melanjutkan secara paralel dengan materi lain), Anda dapat melakukan vikorisasi:

(Penglihatan saluran urogenital);
Potongan selaput lendir mulut, konjungtiva, nasofaring, dan arteri (untuk wanita diambil dari leher rahim dan otot, untuk pria dari uretra);
Slinu;
Sperma;
dari sulur depan;
Jaringan plasenta dan cairan ketuban (cairan ketuban);
Sedimentasi (setelah sentrifugasi), misalnya untuk mengidentifikasi jenis IPSS dan mycobacterium tuberkulosis;
Dahak dan cairan pleura dengan zat yang sama;
eksudati;
Sumsum tulang belakang jika ada kecurigaan adanya lesi menular pada sistem saraf pusat;
Bahan biopsi (bioptat), diambil dari hati, usus 12 cakar, sisik, dll.

Sebelum disebutkan di atas, saya ingin menambahkan bahwa bahan untuk pengujian dalam semua kasus, dalam kerokan dan dalam pengamatan, sudah cukup, beberapa pengujian dengan metode PLR tidak memerlukan banyak usaha, analisisnya terbatas pada banyak Mikroliter harus diambil dari mikrotube tipe ependorf dan dikirim ke Vivchennia.

Penyakit dan stagnasi PLR

Reaksi VIL dan polimerase Lanzug

Jika Anda menjalani tes anonim dan mendapatkan hasil positif, diagnosis imunobloting harus diulangi lagi. Setelah diagnosis dipastikan, pasien akan diberikan pemeriksaan tambahan:

Berdasarkan reaksi imunologi tambahan dari nilai absolut jumlah limfosit CD 4 (sel imunokompeten - T-helper atau sel ginjal), infeksi mana yang menyerang kita terlebih dahulu, setelah itu dikonsumsi, otoritas utama mereka tidak dapat menghancurkan “milik mereka sendiri” "dan milik orang lain." Virus RNA yang bersirkulasi dalam plasma darah disalahartikan sebagai sel normal dalam tubuh dan tidak bereaksi terhadapnya;
Deteksi virus RNA dengan metode PLR dan distribusi konsentrasi partikel virus berdasarkan stadium, tingkat keparahan proses patologis dan prognosis berdasarkan keseimbangan data tersebut. Jelas sekali, kata “norma” hilang dari rencana, sehingga reaksinya selalu positif, dan penguraian nilai-nilai digital berada di bawah kompetensi dokter.

PLR dan hepatitis

Metode PLR dapat mendeteksi hepatitis, paling sering tes ini digunakan untuk mendiagnosis hepatitis, yang sulit didiagnosis dengan metode lain.

Virus hepatitis C (RNA) bertanggung jawab atas perilakunya dalam tubuh manusia. Terjepit dalam genom sel hati (hepatosit), ia tetap berada di sana pada waktu yang tepat, bisa dalam 2 tahun atau 20 tahun, sehingga dokter menyebutnya sebagai “pembunuh mati”. Hepatitis C mengarah pada perkembangan proses ganas di parenkim hati, yang memanifestasikan dirinya pada tahap selanjutnya. Sistem kekebalan tidak memperhatikan semua ini, salah mengira virus sebagai hepatosit. Namun, dalam banyak kasus, antibodi terhadap virus dihasilkan dan tidak melindungi sistem kekebalan. Untuk mendiagnosis ELISA untuk hepatitis C, ini tidak terlalu informatif, karena ini menunjukkan bahwa virus telah kehilangan jejaknya, dan tidak diketahui apakah virus itu sendiri terinfeksi. Dalam kasus infeksi HCV, terjadi kepunahan diri, karena antibodi terhadap virus hilang dan terus beredar selamanya (ingatan imunologis). PLR secara signifikan mendahului pembentukan antibodi dan dapat mendeteksi partikel virus dalam 1-1,5 hari, sedangkan AT dapat muncul dengan interval 2 bulan sebelum melahirkan.

Diagnostik PLR pada kasus yang diduga menyebarkan virus hepatitis C dalam tubuh manusia merupakan metode pemeriksaan yang paling optimal, karena hanya mungkin untuk mengenali adanya “musuh hukum” dalam darah atau biopsi hati pasien. .

Namun terkadang bisa terjadi kejang jika AT positif dan hasil PLR negatif. Metode ini digunakan ketika intensitas virus sangat rendah atau ketika virus “tidak aktif” memasuki hati tanpa memasuki aliran darah. Untuk mengetahui kebenarannya, diperlukan analisis ulang dari pasien, atau bahkan lebih dari satu.

Infeksi virus papiloma

Karena infeksi diri tidak dapat terjadi, maka dimungkinkan juga, tanpa menunjukkan apa pun pada dirinya sendiri, untuk bertahan lama di tubuh penguasa, yang saya tidak curigai harganya, karena fragmen PLR tidak dikembangkan, dan gejala penyakitnya terjadi setiap hari. Namun, keberadaan infeksi papillomavirus, baik yang bersifat laten maupun laten, jauh dari baik bagi kesehatan seseorang, dan sangat berbahaya untuk membawa jenis virus penyebab kanker (tipe 16, 18).

Paling sering, setengah dari populasi menderita IDP, karena virus ini lebih cenderung mempengaruhi bagian tubuh wanita, dan terutama leher rahim, di mana berbagai jenis virus menyebabkan perkembangan proses displastik, dan kemudian kanker serviks, seperti halnya. tidak memaafkan displasia dan memberikan kebebasan mengendalikan virus. Jadi porosnya, reaksi polimerase Lanzug mengungkap DNA virus, dan kemudian jenis “buruk” atau “baik” (onkogenik atau non-onkogenik) menetap di tubuh wanita.

Infeksi IPSS dan TORCH lainnya

Jelasnya, reaksi polimerase Lanczug dapat mendeteksi struktur asing apa pun yang terbentuk dari asam nukleat, sehingga tes ini cocok untuk mengidentifikasi semua infeksi SPS dan TORCH, yang tidak selalu terdeteksi. Mungkinkah melakukan pemeriksaan mahal untuk mengidentifikasi gonokokus, yang tersedia dan lebih murah?

Infeksi TORCH dan IPSS saling berhubungan, jadi penting untuk menentukan kelompok mana yang harus ditugaskan satu sama lain. Mungkin sulit bagi mereka untuk tumbuh dewasa, karena mereka tidak akan terpapar pada kelompok mikroorganisme yang berbeda, yang dapat ditularkan oleh negara, baik hanya untuk pikiran muda (defisiensi imun), atau mungkin menjadi kurang menarik karena pentingnya kemungkinan. masuknya negatif selama kehamilan dan kehamilan.

PLR adalah metode utama untuk mendeteksi infeksi yang didapat

Perkembangan manifestasi klinis didasarkan pada berbagai faktor, yang ditentukan oleh kekuatan PLR saja, yang merupakan tugas utama, baik dengan ELISA maupun dengan sebagai tes konfirmasi tunggal, terutama untuk gejala penyakit. Situasi sulit seperti itu dapat disebabkan oleh infeksi polimikroba, yang selain penyakit nyata, juga mencakup patogen mental.

Ureaplasma paling sering terlihat pada pasangan dengan mikoplasma. Ini bukan untuk apa-apa. Spesies ini, seperti klamidia, bukanlah virus atau bakteri, mereka hidup di tengah sel dan dapat dikaitkan dengan IPSS, meskipun kehadirannya dalam tubuh yang sehat juga tidak jarang terjadi. Jadi, untuk menghilangkan hidung yang sehat dari orang yang sakit, diperlukan metode khusus, dan PLR dianggap paling dapat diandalkan, dengan mempertimbangkan kekhasan perilaku mikroorganisme ini, dll., dan penyelidikan ternyata tidak efektif.

Ada apa (tipe 1, 2) dan yang juga berkaitan dengan virus herpes (tipe 5), maka situasinya ambigu. Tingkat infeksi penduduk bumi sudah mendekati 100%, sehingga pada periode ini sangat penting untuk mengidentifikasi virus dan dosisnya, yang terutama berperan dalam virulensi, dan bahkan pada orang dewasa, virus tersebut Hidup di dalam tubuhnya, he seringkali tidak menyerah pada rasa haus dan tidak menunjukkan tanda-tanda penyakit.

Oleh karena itu, Anda tidak boleh mengabaikan resep dokter untuk reaksi seperti itu, dan bahkan dalam beberapa kasus, reaksi polimerase Lanzug adalah metode diagnostik laboratorium yang wajib dan diperlukan, yang dapat melindungi dari komplikasi serius tidak hanya nku, dan orang kecil, seperti jika dia belum dilahirkan.

Kami ingin memahami bahwa metode ajaib seperti PLR telah melayani umat manusia selama lebih dari 30 tahun. Saat melakukan tes ini, seseorang tidak boleh dibatasi oleh risiko penyakit menular. Reaksi polimerase Lanzug, yang dipopulerkan dalam bidang biologi molekuler, terkait erat dengan genetika. berhasil menghubungi penyelidik kriminal untuk mengidentifikasi orang tertentu, di bidang kedokteran kapal untuk pendirian kedokteran hewan, di bidang kedokteran hewan, sebagai klinik hewan yang dapat membeli properti di jalan, maupun di bidang lain (industri, pemerintahan pedesaan, dll).

Video: PLR - inti dari stagnasi itu

Genetika bakteri Informasi untuk aktivitas lain.

Reaksi Polimerase Lanzug

Reaksi polimerase Lanczug adalah metode yang memungkinkan peningkatan besar (amplifikasi) sejumlah molekul DNA dalam sampel yang dianalisis (termasuk dalam bahan biologis atau kultur murni).

Keuntungan utama PLR sebagai metode diagnostik dalam mikrobiologi adalah sensitivitasnya yang sangat tinggi, yang memungkinkan deteksi konsentrasi patogen yang sangat rendah dalam sampel, serta spesifisitas yang diatur, yang memungkinkan deteksi makhluk Identifikasi pada generik. , spesies atau tingkat subspesies. Bagian utama dari PLR adalah karena sensitivitasnya yang tinggi - sampel dapat dengan mudah mengkontaminasi DNA dari kontrol positif, atau produk PLR, yang akan menyebabkan reaksi negatif-positif. Hal ini memberlakukan pembatasan yang ketat pada pikiran di mana pencampuran PLR dan pengerjaan dengan produk PLR jadi dilakukan.

PLR yang dilakukan. Campuran reaksi sedang disiapkan untuk menggabungkan komponen-komponen berikut:

Saya melihat DNA dari spesimen yang dilacak,

Buferny Rozchin

Ion Mg2+ (diperlukan untuk enzim),

Dua primer adalah molekul DNA pendek beruntai tunggal (paling sering sepanjang 18 hingga 24 nukleotida), saling melengkapi dengan ujung rangkaian DNA berbeda yang terdeteksi.

Sumish deoksinukleotida trifosfat.

DNA polimerase tahan panas (paling sering digunakan Taq polimerase - polimerase terlihat pada termus akuatikus).

Reaksi ini kemudian dapat ditempatkan dalam amplifier, yang sebenarnya diprogram oleh termostat. 30-40 siklus perubahan suhu dilakukan di amplifier. Kulit dari siklus ini terdiri dari tiga tahap (div. Gambar 1):

Denaturasi (suhu 94°W) – tombak air pecah, dan tombak DNA menyimpang.

Primer telah turun (suhu sekitar 50-60°C) – primer ditambahkan ke ujung rangkaian DNA. Sementara itu, pada suhu rendah, munculnya untaian DNA keluaran dari fragmen yang dilacak (renaturasi) secara energetik lebih menguntungkan, karena konsentrasi primer dalam campuran reaksi jauh lebih besar. urutan (misalnya, pada siklus tongkol PLR), reaksi primer berlangsung dengan penurunan DNA . Suhu leleh dipilih berdasarkan suhu leleh (denaturasi) primer.

Pemanjangan (suhu 72 °C) – DNA polimerase menghasilkan primer dari matriks DNA yang panjang. Suhu menunjukkan suhu optimal untuk produksi DNA polimerase vikorisasi.

Deteksi hasil bervariasi dalam versi PLR yang berbeda dan dijelaskan di bagian “Jenis PLR”.

Dinamika PLR

Pada awal siklus PLR, sejumlah molekul DNA ganda, yang ukurannya ditentukan oleh posisi antara lokasi pendaratan primer, berinteraksi dengan siklus kulit. Dengan cara ini, sejumlah kecil molekul DNA tercipta dan dapat diekstraksi (div. Gambar 2).

Jadi, pada siklus awal, kekuatan produk PLR dijelaskan dengan rumus m*2 n, dimana m adalah hasil sampel DNA, n adalah jumlah siklus. Kemudian reaksinya mencapai titik tertinggi. Hal ini terjadi melalui akumulasi produk reaksi, penurunan konsentrasi primer dan deoksinukleotida trifosfat, serta peningkatan konsentrasi pirofosfat (Gbr. 3).

Riznovidi PLR

Konvensi PLR

Pada reaksi PLR versi ini kemudian dipilih jumlah siklus (30-40), setelah itu dianalisis apakah terdapat akumulasi molekul DNA vulkanik pada campuran reaksi.

Pilihan penentuan stadium PLR pada kasus varises sebagai metode diagnostik adalah metode yang jelas. Reaksi positif menunjukkan adanya jejak molekul DNA yang terdapat pada gambar. Reaksi negatif untuk menginformasikan keberadaannya. Penilaian kuantitatif terhadap molekul DNA keluaran tidak mungkin dilakukan melalui respons terhadap keadaan stabil.

Metode utama untuk mengidentifikasi produk adalah elektroforesis pada gel agarosa atau poliakrilamida. Produk PLR dipisahkan dalam gel di bawah medan listrik untuk mengurangi berat molekulnya. Gel mengandung barberry interkalasi (berpendar dalam keadaan terikat DNA - paling sering bromida etida). Dengan demikian, bila terkena sinar ultraviolet, akan dimungkinkan untuk mendeteksi ada tidaknya suatu tanda yang menunjukkan DNA dari massa molekul yang dibutuhkan. Selama jam pelaksanaan PLR untuk tujuan diagnostik, kontrol reaksi positif dan negatif selalu dilakukan, yang menghasilkan tanda-tanda yang sama (div. Gambar 4).

PLR secara real-time

Dalam versi produksi PLR ini, kekuatan produk PLR dalam campuran reaksi dicatat secara terus menerus selama reaksi berlangsung. Hal ini memungkinkan untuk menghasilkan kurva reaksi (div. Gambar 3) dan, berdasarkan kurva tersebut, mengekstraksi sejumlah molekul DNA yang berbeda dari partikel.

Salah satu jenis PLR yang dilakukan secara real time adalah dengan menggunakan zat interkalasi vicoristic, yang ditambahkan langsung ke dalam campuran reaksi (paling sering vicoristic SYBRGreen). Jenis lainnya adalah penggunaan salah satu jenis probe fluoresen yang dihubungkan ke ruang di tengah produk PLR, yang memungkinkan seseorang untuk meningkatkan spesifisitas deteksi (div. Gambar 5). Deteksi fluoresensi dilakukan terus menerus selama reaksi.

Selain kemungkinan deteksi cepat, keunggulan lain PLR secara real time terungkap sejalan dengan konvensi. Versi PLR ini lebih sederhana, cepat, dan juga tidak memerlukan pembukaan tabung dengan produk PLR, sehingga mengurangi kontaminasi partikel lain. Kerugian utama adalah kinerja penguat yang lebih tinggi karena peningkatan kemampuan mendeteksi fluoresensi dibandingkan dengan aslinya.

PLR Kilkisna Digital

Varian PLR yang baru, mahal, dan masih memiliki cakupan yang rendah, yang memungkinkan penentuan kekuatan DNA dalam suatu sampel dengan lebih akurat. Dalam versi ini, reaksi campuran, yang mengandung barnberry fluoresen, dibagi menjadi sejumlah besar volume mikroskopis (misalnya, tetesan dalam emulsi). Setelah menjalani PLR, dianalisis bagian tetesan mana yang bereaksi positif dan ternyata terjadi fluoresensi. Porsi ini akan sebanding dengan jumlah molekul DNA yang ditemukan pada setiap individu.

PLR dari transkripsi pembalikan

Sebelum PLR ini atau versi lainnya, reaksi pembalikan transkripsi (RNA menjadi DNA) dengan bantuan enzim revertase dihambat. Dengan demikian, metode ini memungkinkan identifikasi molekul RNA secara tepat. Ini dapat digunakan untuk mendeteksi virus RNA atau untuk menentukan tingkat transkripsi (mRNA) gen tertentu.

Malyunok 1. Tapi PLR. Primer ditandai dengan warna merah.

Malyunok 2. Akumulasi molekul DNA ganda, dikelilingi oleh primer, selama PLR.

Malyunok 3. Dinamika reaksi PLR pada berbagai konsentrasi molekul DNA yang terdapat dalam sampel. (a) – konsentrasi tertinggi (b) – konsentrasi menengah (c) – konsentrasi terendah

Malyunok 4. Elektroforesis agarosa produk PLR. K+ - kontrol positif (dibalik keberadaan DNA yang terdeteksi). 1-7 - jejak selanjutnya (1-2 positif, 3-7 negatif). Kontrol K-negatif (video dna sukana DNA). Dalam banyak kasus, selain produk keseluruhan, produk reaksi nonspesifik yang lebih ringan (dimer primer) juga terlihat.

Malyunok 5. Metode deteksi di bawah jam vikoristannya PLR dalam jam. (a) – barnberry interkalasi – berfluoresensi ketika terikat pada DNA untai ganda (b) – Probe Taqman – fluoresensi terjadi ketika probe DNA dibelah oleh DNA polimerase dengan aktivitas endonuklease 5'-3' untuk cacat dan pemadam membran fluoresen. (c) – Probe MolecularBeacon - fluoresensi muncul selama hibridisasi probe dengan seluruh fragmen di luar ruang fluorofor dan pemadam jarak jauh (d) – Probe LightCycler - fluoresensi akseptor muncul selama hibridisasi probe yang ditransfer nya (FRET).

Reaksi berantai polimerase (PLR, PCR – reaksi berantai polimerase) adalah metode untuk menghilangkan salinan anonim fragmen DNA (gen) dari virus biologis.

Inti dari PLR sebagai metode biologi molekuler terletak pada salinan sampel gen lagu (ekstensi DNA) dalam skala besar dengan bantuan enzim khusus di otak. secara in vitro. Fitur penting dari PLR adalah penghapusan salinan bagian tertentu dari DNA (gen), yang sesuai dengan pikiran tertentu. Sinonim dari proses penyalinan DNA adalah “amplifikasi”. Replikasi DNA secara alami Anda juga dapat menggunakan amplifikasi. Namun, sebagai hasil replikasi, bagian pendek DNA (maksimum 40.000 pasangan nukleotida) diamplifikasi selama reaksi polimerase Lancug.

Prinsip dasar

Selain itu, PLR adalah penyalinan karbonase dari fragmen DNA secara in vitro selama siklus suhu yang berulang. Bagaimana proses reaksi terjadi dalam satu siklus suhu?

Sintesis tombak nukleotida dilakukan oleh enzim DNA polimerase. Namun, agar tongkolnya dapat bekerja, enzim tersebut memerlukan landasan awal. Seperti Maidan, “primer” (biji) bertindak sebagai oligonukleotida sintetik dengan total 15-20 nukleotida. Ada dua primer (maju dan mundur), keduanya saling melengkapi pada bagian cetakan DNA dan fragmen DNA itu sendiri, dikelilingi oleh primer, disalin oleh DNA polimerase. Pekerjaan polimerase terletak pada penambahan berurutan nukleotida yang melengkapi urutan cetakan DNA. Tim sendiri, dalam satu siklus suhu, kembali mensintesis dua fragmen DNA baru (karena molekul DNA adalah Dolantsyuzhkova, maka ada dua matriks). Jadi, selama 25-35 siklus, miliaran salinan plot DNA yang diidentifikasi oleh primer terakumulasi dalam sampel. Struktur siklus tertutup dapat direpresentasikan sebagai berikut:

Denaturasi DNA (peleburan, hancurnya tombak DNA) – 95°C – 1 atau 2 hvilin;
jatuhnya primer (primer berikatan dengan cetakan DNA, suhu tahap ini ditentukan oleh komposisi nukleotida primer) - 60 ° C (misalnya) - 1 hvilina;
Pemanjangan DNA (polimerase mensintesis DNA) - 72°C - 1 jam (biarkan selama satu jam sampai fragmen disintesis).

Dasar praktis pengujian metode reaksi polimerase Lanziug di laboratorium harus terdiri dari:

(atau yang juga disebut thermal cycler);
sistem untuk s (untuk visualisasi hasil PLR);
sistem (untuk menganalisis hasil PLR);
(Untuk persiapan sampel);
set (mekanik dan elektronik).

Selain peralatan utama dan tambahan agar laboratorium PLR berfungsi penuh, terdapat bahan-bahan yang diperlukan: ujung steril, tabung, rak tabung dan dispenser.

Basis reagen di laboratorium PLR awal untuk melakukan reaksi Lancug polimerase lengkap meliputi enzim DNA polimerase dengan buffer, primer (fragmen DNA sintetik kecil yang melengkapi batang dan ujung bagian matriks DNA yang dianalisis), jumlah dari nukleotida (A, T, G, C) . Air murni juga mutlak diperlukan.

Kelebihan metode PLR

Sensitivitas penyelidikan yang tinggi

Sensitivitas metode ini sedemikian rupa sehingga amplifikasi PLR dan identifikasi urutan target dapat dicapai jika terjadi setiap 5 sel sekali.

Kekhususan analisis

PLR memungkinkan untuk mendeteksi DNA agen infeksi tertentu dengan adanya DNA mikroorganisme lain dan DNA organisme inang, serta melakukan genotipe. Dengan memilih komponen reaksi (primer) secara spesifik, Anda dapat langsung mendeteksi DNA mikroorganisme terkait.

Fleksibilitas metode PLR

Di sebelah kanan, untuk diagnosis penyakit menular dan penyakit menular pada manusia dengan PLR, seseorang dapat menggunakan pengetahuan yang sama, mengikuti prosedur universal untuk menyiapkan spesimen (sampel) dan melakukan analisis, serta peralatan reagen serupa.

Menghemat waktu

Keuntungan penting dari PLR adalah banyaknya tahapan kerja mikrobiologi budaya. Persiapan sampel, melakukan reaksi dan menganalisis hasil bantuan maksimal dan banyak otomatisasi. Bagaimanapun, hasilnya bisa turun dengan cepat hingga 4-5 tahun.

Efisiensi metode PLR

Luasnya materi klinis yang dipelajari

Sebagai hasil dari reaksi polimerase Lanczyg, tidak hanya bahan biologis yang dapat dihilangkan dari penyakit, tetapi juga banyak substrat lain, di mana molekul DNA dapat diidentifikasi dengan tingkat kelelahan yang tinggi, misalnya air, tanah, produk makanan, mikroorganisme. , dan banyak lagi.

Semua keuntungan terpenting dari metode unik ini adalah sensitivitas dan spesifisitas tinggi, identifikasi agen infeksi dan genotipe gen manusia, efisiensi tinggi dan penghematan waktu, universal. Tidak ada dasar praktis - metode PLR saat ini dapat digunakan secara luas dalam diagnosis klinis , praktik medis, dan penelitian ilmiah serta kekayaan di bidang lainnya.

Zastosuvannya PLR

Area stagnasi reaksi polimerase Lancug akibat metode biologi molekuler saat ini bervariasi. Ia kaya akan luasnya bahan yang dapat dianalisis (hampir segala sesuatu yang DNA dapat dilihat lebih jelas dapat menjadi subjek penyelidikan), serta primer yang dipilih. Bidang utama penerapan PLR:

obat klinis

ekologi

memantau perkembangan dovkilla
analisis produk makanan
analisis organisme hasil rekayasa genetika (GMO)

kedokteran kapal dan forensik

Identifikasi individu
pembentukan Tanah Air

farmakologi

kedokteran hewan

penelitian ilmiah (biologi molekuler, genetika)

Organisasi laboratorium PLR

Informasi untuk kontrak

Nama	Tentang kami	Virobnitstvo	metode	Kucing.Tidak.

PLR - diagnosis infeksi, metode langsung dan presisi tinggi untuk mendeteksi berbagai penyakit menular. Apa perbedaan antara analisis lainnya?

Singkatan ini singkatan dari reaksi Lanzug polimerase. Menurut Wikipedia, Keri Mullis lahir pada tahun 1983, sejarah Amerika. Atas kontribusinya, ia ditolak Hadiah Nobelnya.

Terakhir kali PLR berjaya hanya dengan menggunakan metode ilmiah, setelah itu berhasil didirikan secara kedokteran. Inti dari penyelidikan terletak pada pengenalan agen infeksi berdasarkan DNA dan RNA. Penyakit kulit, menembus DNA, mengubah strukturnya ke jenis yang berbeda. Saat melihat perubahan DNA, asisten laboratorium menyadari bagaimana penyakit terjadi pada manusia. Keunggulan lain dari PLR antara lain:

Identifikasi penyebab utama infeksi yang kehilangan “jejak” dalam DNA. Ketika banyak penyakit teridentifikasi, penting untuk mengidentifikasi asal muasal penyakit tersebut. Dan untuk diagnosis yang benar dan pemilihan pengobatan yang efektif, reaksi Lanzug sangatlah penting;
Itu dipasang pada PLR saat DNA telah diubah, dan pada tahap transformasi tertentu. Hal ini diperlukan untuk menyingkirkan infeksi yang meragukan;
Diagnostik PLR sensitif dan mendeteksi keberadaan bakteri dan virus tunggal. Bau busuk bisa hilang dalam darah setelah mandi yang salah ditentukan atau penghentian mandi yang tidak direncanakan. Jumlah minimum yang didiagnosis saat mendekode PLR adalah 10 hari klien. Metode pengujian lainnya berukuran lebih kecil;
Mikroorganisme patogen terdeteksi tergantung pada manifestasi gejala PPSS. Penyakit yang terdeteksi pada stadium awal tidak akan bertahan lama seperti pada stadium lanjut;
Hasil PLR penyakit akan dibawa ke tangan agar cepat selesai. Dibutuhkan lebih dari 4-6 tahun untuk mendiagnosis infeksi. Bersamaan dengan dekripsi, seluruh proses memakan waktu lebih dari 1-2 hari;
Pada suatu waktu, bahan DNA diekstraksi untuk melakukan 5-6 tes. Orang yang sakit tidak akan mempunyai kesempatan untuk menjalani pemeriksaan apusan berkali-kali;
PLR dan pelacakan infeksi tidak tinggal diam, bidang ini terus berkembang. Dengan ditemukannya sistem pengujian baru dengan sensitivitas yang meningkat, kemungkinan dilakukannya tindak lanjut berkurang. Karena sebelumnya obat ini hanya tersedia bagi penduduk kota-kota besar, kini para dokter di klinik rumah sakit di daerah tidak dapat membayangkan mengobati penyakit tanpa obat tersebut.

Fitur metode PLR:

Akurasi (koreksi minimal dan frekuensinya tidak melebihi 0,01%);
Sensitivitas (tes “menghitung” bakteri individu dalam darah dan apusan);
Spesifisitas (PLR mendeteksi infeksi yang seringkali tidak muncul sampai tahap penting);
Keunikan (analisis hasil dalam situasi ketika penyelidikan lain tidak mengungkapkan apa pun).

Hasil analisis PLR

Bagaimana cara kerja metode reaksi Lanzug dan bagaimana persiapan sebelum analisis?

Reaksi Lanzug di otak laboratorium mentransmisikan penggandaan plot DNA dan RNA yang kaya dengan mengidentifikasi bagian rusak yang sama. Asam diperkuat (terkonjugasi) dengan bantuan sediaan enzim. Dengan menggunakan enzim vikoristik, asisten laboratorium menghilangkan salinan fragmen DNA patogen dalam jumlah yang cukup untuk menyelaraskan PLR dari gejala penyakit ini dan penyakit lain yang dipicu oleh infeksi.

Biasanya, bahan biologis yang diambil dengan pengambilan sampel atau apusan dianalisis. Untuk identifikasi (menguraikan infeksi menular seksual), diambil apusan dari epidermis, leher rahim atau rahim untuk PLR. Terkadang vikorist juga bertarung.

Untuk memastikan atau mendeteksi adanya hepatitis, toksoplasmosis atau HIV, ambil darah dari vena. Darah yang diambil dari jari seringkali memberikan hasil yang negatif seperti susu. Mononukleosis didiagnosis setelah mengumpulkan bahan tenggorokan bagal. Tuberkulosis dapat dideteksi setelah pengumpulan dahak, seperti terlihat jelas pada pasien dengan luka.

Apusan dari rahim dan leher rahim untuk PLR adalah analisis yang sederhana, tidak ada main-main dengan hal itu. 2-3 hari sebelum acara, Anda akan dianjurkan untuk menjalani kehidupan formal. Saat ini, gel dan susu secara alami digunakan untuk kebersihan khusus. Anda bisa minum air hangat dari keran. Berhenti mencuci - malam sebelum luka ke laboratorium atau kantor dokter.

Pengobatan sariawan dengan bantuan krim, salep, supositoria dan semprotan yang dilakukan juga penting. Apusan diambil pada panggul pertama setelah atau segera setelah menstruasi. Untuk memperoleh hasil yang akurat, disarankan untuk tidak ke toilet selama 2-3 tahun sebelum pengambilan apusan PLR.

Pada orang yang mengalami reaksi Lanziug, usapan diambil dari uretra. Bahan biologis dikumpulkan menggunakan alat steril atau kapas, yang dimasukkan ke dalam benih. Selama jam prosedur, Anda mungkin mengalami sedikit ketidaknyamanan atau pembengkakan pada hati. Masyarakat juga harus menghabiskan banyak waktu untuk belajar tentang seks dan kebersihan. Periode sebelum analisis, pengobatan dengan antibiotik dan obat lain ditentukan. Jika rasa tidak nyaman terus berlanjut setelah pengambilan, disarankan untuk pergi ke klinik sesegera mungkin.

Boleh saja pasien menjalani pemeriksaan darah atau pengambilan apusan dari organ tubuh pasien. Materi genetik ditempatkan dalam perangkat amplifikasi PLR, dan enzim ditambahkan di sana. DNA dipanaskan hingga suhu 90-95°C hingga lanyard terbentuk menjadi tusuk sate. Proses ini disebut denaturasi. Selama jam pengoperasian reaktor, dari satu sampel DNA dan RNA, ribuan salinan dibuat untuk dianalisis (menguraikan reaksi).

Hasil diagnosa PLR

Reaksi Lanzug menunjukkan tingkat keparahan infeksi, dan jumlah komplikasi yang jelas terlihat. Penguraian sisa batuan merupakan pengenalan gen mutasi secara individu ke dalam DNA manusia untuk mengungkap kemampuan mengubah genotipe.

Apa yang terungkap dari diagnosis infeksi PPR?

Penguraian hasil analisis terlihat jelas oleh dokter yang berkualifikasi. Kekuatan reaksi Lanczyg memungkinkan kita untuk memastikan atau mendeteksi adanya penyakit seperti:

Seperti yang jelas dari daftar ini, diagnostik PLR memberi dokter berbagai macam spesialisasi yang sangat terspesialisasi tanpa kemampuan terbatas. Metode ini dapat digunakan di bidang pulmonologi, virologi, penyakit menular, onkologi, gastroenterologi, hematologi, ginekologi dan urologi.

Dekripsi PLR: hasil

Analisis reaksi Lancug dinilai oleh dokter secara individual untuk pasien kulit dengan patologi yang jelas dan penyakit kronis. Hasil analisis PLR menunjukkan, sebagaimana telah dikatakan di atas, ciri-ciri spesifik bakteri patogen. Saat menanganinya, dokter menentukan tingkat keparahan dan stadium penyakit. Berdasarkan indikator-indikator ini, dosis obat dan lamanya pengobatan juga ditunjukkan.

Hasil PLR negatif berarti bahan biologis yang dikumpulkan menunjukkan adanya virus atau infeksi setiap hari. PLR positif merupakan sinyal sebelum alarm. Infeksi juga terdeteksi pada darah dan area biologis pasien lainnya.

Karena nilainya minimal, kita dapat berbicara tentang kehadiran penyakit yang sederhana, dan tidak hanya tentang perkembangan aktif penyakit. Pembawa infeksi sederhana, yang hanya memanifestasikan dirinya dalam PPR, tetapi tidak menunjukkan gejala lain yang biasa, harus selalu berkonsultasi dengan dokter.

Penting untuk tidak panik dan ingat bahwa sebagian besar virus yang diketahui ilmu pengetahuan dapat diobati dengan obat antibakteri. Memilihnya dan menggantinya dengan yang lain jika tidak efektif dapat menghilangkan kualifikasi dokter, sebagaimana dibuktikan dengan pengobatan penyakit ini dan penyakit lainnya.

Dekripsi PLR dapat dilakukan tidak hanya atas kebijaksanaan dokter, tetapi atas kebijaksanaan pihak berwenang. Seringkali kita merasa takut pada wanita yang berencana hamil dalam waktu dekat demi menghindari kemungkinan terkena penyakit menular seksual. Ketika ditempatkan pada konsultasi regional dengan pasien, tidak diperlukan diagnosis menyeluruh.

PLR diresepkan untuk wanita wajib, yang telah melakukan sedikit aborsi atau aborsi karena berbagai alasan. Sebelum EBC, dilakukan analisis untuk mengidentifikasi semua penyebab kemungkinan keluarnya sel telur yang telah dibuahi.

Orang sering melakukan PLR setelah rilis, pada saat liburan romantis atau pernikahan. Diagnostik membantu mereka untuk tidak membahayakan nyawa mereka dan kesehatan calon pasangan seksual.

Seringkali, PLR adalah satu-satunya kesempatan bagi pasien untuk pulih dari penyakit pada tahap embrio, jika risiko yang tidak perlu dipersulit oleh perjalanan yang sulit.

Apusan menggunakan metode PLR untuk mendiagnosis penyakit menular mungkin menjadi lebih penting:

Diagnosis langsung penyakit dan penyakit menular.

Banyak metode diagnostik laboratorium tradisional mengandalkan deteksi penyakit sehari-hari untuk berbagai tanda tidak langsung. Misalnya, diagnosis ELISA didasarkan pada protein yang terdeteksi dalam darah pasien, yang merupakan produk pemecahan agen infeksi, yang menjadi dasar dokter dapat membuat diagnosis lain. Metode analisis PLR memberikan indikasi langsung adanya sampel DNA spesifik penyakit pada bahan yang diambil dari pasien.

Spesifisitas diagnostik PLR yang tinggi.

Selama proses analisis, materi yang diperiksa mengungkapkan sebuah fragmen DNA yang spesifik dan memiliki kekuatan untuk organisme tertentu – baik bakteri atau virus. Potongan DNA ini unik dan tidak khas untuk infeksi hewan di bumi.

Sensitivitas PLR yang tinggi.

Infeksi dapat terjadi jika bahan yang diambil dari pasien mengandung kurang dari satu sel bakteri atau virus. Dibandingkan dengan metode diagnostik imunologi dan mikrobiologi lainnya: sensitivitas analisis PLR – 10-100 sel per sampel, metode lain – 103-105 sel.

0Array (=> Analisis) Array (=> 2) Array (=>.html) 2

Fleksibilitas analisis PLR.

Untuk penyelidikan PLR, dimungkinkan untuk menggunakan hampir semua bahan yang tidak tersedia untuk diselidiki dengan metode lain: lendir, potongan, darah, serum, dahak, ejakulasi, potongan sel epitel - fragmen, dll. bahan atau tisu.

Ada tingkat dukungan yang tinggi terhadap hasil analisis PLR.

Metode seragam untuk semua pemrosesan bahan yang diambil dari pasien untuk analisis, deteksi produk reaksi, amplifikasi PLR otomatis memungkinkan diagnosis PLR baru dalam 4-5 tahun. Pada saat yang sama, lebih dari satu jam dihabiskan untuk metode pengamatan budaya - dari beberapa hari hingga beberapa hari, karena perlu untuk melihat, dan kemudian mengembangkan patogen pada kultur sel.

Kemungkinan mendiagnosis segala jenis infeksi.

Sensitivitas tinggi dari metode PLR memungkinkan untuk mendiagnosis infeksi tidak hanya pada tahap akut penyakit, tetapi juga untuk mendeteksi infeksi kronis dan mengidentifikasi bakteri dan virus tertentu.

Apusan dengan metode PLR memungkinkan untuk mendeteksi infeksi yang tidak dapat dideteksi dengan apusan flora: klamidia, ureaplasmosis, mikoplasmosis, herpes genital.

Apa keuntungan signifikan dari metode investigasi dan diagnostik PLR? Kekurangan diagnostik PLR meliputi:

Kemungkinan memperoleh hasil positif

Analisis PLR dapat menunjukkan hasil positif jika infeksi sudah mati, “dibunuh” oleh antibiotik, dan sel-sel mati masih berada di jaringan pasien. Bagaimana mungkin? Sederhananya. Misalnya, infeksi hidup di jaringan epitel (pada selaput lendir organ atau mata). Mereka berdua menikmatinya. Dibutuhkan satu jam untuk “memperbarui” epitel sel. Jika bahan tersebut diambil oleh dokter sebelum sel-selnya diperbarui sepenuhnya, bahan tersebut mungkin mengandung sel-sel infeksi yang mati. Klitini jelas menghilangkan materi genetik - DNA atau RNA tubuh, seperti yang dipikirkan PLR. PLR tidak memisahkan sel mati dari sel hidup: PLR mencari DNA dan “mengkloning” sel tersebut dalam jumlah besar. Hasil analisis tersebut positif. Faktanya, memang benar bahwa kita adalah hybnopositif.

Ketidakmampuan PLR untuk “memulihkan” infeksi yang mati dari infeksi yang masih hidup membuat sulit untuk mendeteksi PLR dan mengontrol efektivitas pengobatan. Aturan utamanya, tentu saja, adalah memastikan bahwa sisa-sisa infeksi yang mematikan benar-benar dihilangkan dari tubuh, sehingga rata-rata orang dapat bertahan selama 4-8 tahun. Oleh karena itu, setelah meminum sisa tablet antibiotik, metode PLR dapat dan harus digunakan untuk memantau efektivitas pengobatan.

gastroenterologi kompleks diagnostik - 5360 rubel

Penghematan TILKI DI BEREZNY - 15%

1000 rubel Mengambil EKG dari decoding

- 25%utama
Periksa ke dokter
terapis di akhir pekan

980 gosok. janji pertama dengan ahli hirudoterapis

janji temu dengan terapis - 1130 rubel (bergantian 1500 rubel) "Hanya selama seminggu, pada hari Sabtu dan minggu, menemui terapis dengan diskon 25% - 1.130 rubel, bukan 1.500 rubel (prosedur diagnostik dibayar sesuai daftar harga)

Pada tahap selanjutnya, pengendalian larangan dapat dilakukan dengan menggunakan metode budaya yang berbeda, atau dengan menabur: hanya mikroorganisme hidup yang berkembang biak yang dapat menjadi tanda nir-kekerasan.

Tidak disarankan menggunakan analisis PLR untuk mendiagnosis gardnerellosis, karena gardnerelli - penderita penyakit ini, dalam sejumlah kecil kasus, biasanya hidup di dalam tanah. DNA bakteri dengan PLR vicoristic ini akan segera hilang. Gardnerella tidak muncul pada apusan, dan bakterioskopi dalam kasus ini merupakan metode yang cukup untuk mendiagnosis gardnerellosis dan memantau pengobatan.
Berbagai mikroorganisme

Mikroba apa pun dapat berubah, dan pada saat yang sama seperti DNA. Bokong terindah dari galus ini adalah virus flu. Setelah sakit sekali, seseorang mengembangkan antibodi terhadap virus. Secara teoritis murni, jika kita terkena flu sekali saja, sama seperti flu, bukan salah kita kalau kita sakit lagi. Kami hampir merasakan sakit di tenggorokan. Apa alasannya? Virus “bermutasi”, sedikit “mengubah” genomnya, dan sistem kekebalan kita, antibodi kita tidak lagi “mengenali” tamu lama dalam bentuk baru. Bukan hal gila jika saya terkena flu lagi...

Saat merancang penguat (sistem pengujian PLR), dipilih fragmen DNA khusus untuk mikroorganisme tertentu yang paling tidak rentan terhadap perubahan. Itu “dipilih” dari apa yang disebut bagian DNA yang sangat konservatif. Alternatifnya, banyaknya mikroorganisme dapat mengarah pada fakta bahwa genotipe atau strain tertentu dari organisme yang diamati dapat menyebabkan mutasi pada genom, yang menguatkan (mengkloning), dan dengan demikian menjadi sulit dipahami oleh sistem pengujian.

Dengan demikian, sistem pengujian yang berbeda menjadi salah satu alasan mengapa analisis yang dilakukan di laboratorium berbeda dan di klinik berbeda dengan menggunakan metode PLR yang sama dapat menunjukkan hasil yang sangat berbeda. Untuk menghindari mutasi sebanyak mungkin, standar kini telah dikembangkan untuk mengatur pengujian (termasuk pengujian reaksi silang, serta pengujian strain rumah tangga yang terindikasi), yang memerlukan sistem pengujian, hal pertama yang harus dilakukan di pasar dan Akankah Vicoristan digunakan untuk mendiagnosis kesehatan Anda?Mengapa klinik dan laboratorium yang baik menggunakan Vicoristan untuk sistem pengujian generasi berikutnya. Dan pusat medis kami "Euromedprestige" adalah salah satu dari sedikit yang dapat memberikan diagnosis yang jelas kepada kliennya.