Golovna Symptómy Ako vykonať diagnostiku PCR Analýza pomocou metódy PCR. Vysoká citlivosť vyšetrovania

Ako vykonať diagnostiku PCR Analýza pomocou metódy PCR. Vysoká citlivosť vyšetrovania

PLR (polymerázová Lanzugova reakcia) je výdobytok molekulárnej biológie, jedna z hlavných metód klinickej laboratórnej diagnostiky na konci 20. storočia a na začiatku 21. storočia, ktorá prináša veľké škody rôznym pacientom lekárskej vedy.

Takýmto spôsobom, ako uprostred miliónov buniek ľudského tela, nie je zničený samotný živý vírus, ale len časť jeho DNA, potom sa PLR, keďže ho to nemôže obťažovať, pokúša vyhnúť sa úlohe a informovať o prítomnosti „mimozemšťana“ „pozitívny výsledok. Podstatou PLR je jeho hlavná výhoda.

Hydratácia a nedostatky

Laboratórium, ktoré vykonáva diagnostiku PLR, má vysokú potrebu dostupnosti testovacích systémov a kvalifikácie zdravotníckeho personálu. Ide o high-tech laboratórium, ktoré má dobre usporiadaný arzenál vysoko citlivých a vysoko špecifických činidiel, takže neexistujú žiadne špeciálne nedostatky. Čokoľvek, čo pri absencii klinických prejavov vykazuje pozitívny výsledok a stavia tak lekára pred dilemu: máme začať liečbu alebo nie?

Lekár, ktorý sa stará o pacienta, začína pochybovať o spoľahlivosti výsledkov testov, pokiaľ nie sú žiadne známky choroby. Vysoká citlivosť systému PLR je však založená na pamäti, že odhaľuje budenie už v predklinickom štádiu a pozitívny výsledok je v tomto prípade skôr ako o rok, a to ani zďaleka. Na základe toho je lekár zodpovedný za vlastné rozhodnutia o užitočnosti terapie, pričom berie do úvahy ďalšie argumenty „za“ a „proti“.

Výhody diagnostiky pomocou polymerázovej Lanziugovej reakcie sú zrejmé:

Vysoká špecifickosť, ktorá dosahuje 100 %, je spôsobená prítomnosťou častíc nukleových kyselín vo vzorke, ktoré sú silné v určitom organizme alebo sú pre človeka cudzie;
Vysoká produktivita a dokonca aj PLR je high-tech automatizovaná technika, ktorá umožňuje vykonávať testovanie v deň odberu materiálu a rutinne liečiť pacienta v prípade akejkoľvek úzkosti;
PLR, pracujúci na jednej poruche, môže vykonať sériu vyšetrovaní o odhaliť množstvo sviatkov ako keby bola takým pokladom. Napríklad pri diagnostike chlamýdiovej infekcie, keď sa PLR aplikuje na hlavné metódy, aby sa chlamýdie, možno odhaliť Neisser (gonokok) - alarmista. Okrem toho neexistuje žiadny negatívny vplyv na spoľahlivosť výsledkov;
Testovanie metódou PLR odhalí nebezpečné mikroorganizmy počas inkubačnej doby Ak choroba ešte nedosiahla koniec tela, potom včasná diagnostika predpokladá budúci vývoj patologického procesu, čo umožňuje pripraviť sa na niečo nové a prijať to z celku.

Okrem toho, aby sa odstránil zmätok, ktorý niekedy vzniká pri diagnostike, PLR sa chráni tým, že jej výsledky je možné zaznamenať (fotografovať, počítač) metódou ich vikorizácie u odborníkov na potrebné účely.

Normou v typoch PLR je hodnotiť negatívne výsledky, ktorý indikuje prítomnosť fragmentov cudzích nukleových kyselín, pozitívny dôkaz indikuje prítomnosť infekcie v tele, digitálne hodnoty indikujú silu vírusu a jeho koncentráciu v čase testovania. Proteo externe dešifroval analýzu tohto lekára, ktorý urobil špeciálnu štúdiu na tému „PLR“. Nemá zmysel pokúšať sa interpretovať výsledky sami, pretože môžete, čo sa stane, nepochopiť a začať sa chváliť.

Čoho sa PLR obáva, čo dokáže a ako sa na to môžeme pripraviť?

Ako každé iné vyšetrovanie, Niekedy sú výsledky testov buď pozitívne alebo negatívne, de PLR nie je na vine. V takýchto situáciách môže nastať nasledovné:

Prerušenie technologického procesu do jedného z etáp reakcie;
Nedotrimannya pravidlá pre zber materiálu, jeho uchovávanie a prepravu;
Prítomnosť prvkov tretích strán v materiáli.

To znamená, že pred PLR - diagnostikou infekcií je potrebné k nej pristupovať s rešpektom, obozretne a presne, inak môže materiál zmeniť svoju štruktúru alebo úplne skolabovať.

Etapy diagnostiky PLR. Výsledky Milkova môžu byť narušené v ktorejkoľvek fáze vyšetrovania.

PLR diagnostika infekcií spadá medzi ostatné laboratórne metódy do kategórie „zlatých štandardov“, takže sa pomocou nich dajú odhaliť každodenné choroby bohatých, ktoré na prvý pohľad nič zásadné nenasvedčujú.

Tuberkulóza rôznej lokalizácie, pneumónia (vrátane atypickej pneumónie spôsobenej chlamýdiami);
Detské infekcie (kravská rubeola, mumps, cvrlikanie);
záškrtu;
Salmonella;
Zoonotické infekčné ochorenie - listerióza (ochorenie je charakterizované rôznymi príznakmi v dôsledku poškodenia lymfatických uzlín, centrálneho nervového systému, vnútorných orgánov);
Choroba spôsobená vírusom Epstein-Barrovej (infekčná mononukleóza atď.);
Onkologická patológia vyvolaná infekciou papilomavírusom (IDP tohto typu);
Borelióza (lymská borelióza, kliešťová encefalitída);
Infekcia Helicobacter pylori spôsobená mikróbom Helicobacter pylori, ktorý žije vo vulve človeka. Je dokázané, že Helicobacter pylori spôsobuje rozvoj rakoviny scuta alebo 12-miestneho hrubého čreva;
a prakticky všetko.

Diagnóza PLR infekcií, ktoré sú prenášané štátom, je obzvlášť dôležitá, keď fragmenty choroby, kričiace týmto spôsobom, často prejdú ťažkú hodinu bez akýchkoľvek klinických prejavov, potom, keď začne závažnosť, začne sa činnosť. takýmto spôsobom ohrozovať zdravie a ničiť život dieťaťa. Použite i rovnakým spôsobom. Akcie od nich („pochodeň“) sú nastavené okamžite a až do ІПШ, potom ostatné vyžadujú posúdenie správy. Viac o najpopulárnejších metódach sa dozviete v nasledujúcich častiach článku.

Ako sa správne pripraviť, aby ste dosiahli spoľahlivý výsledok?

Je dôležité poznamenať, že príprava na PLR je jednoduchá a nevyžaduje žiadne zvláštne úsilie zo strany pacienta. Je potrebné podpísať tri nepríjemné úlohy:

Nekontaktujte článok 24 rokov pred dátumom analýzy;
Ak chcete odobrať a analyzovať krv zo žily, musíte prísť na postnú loď, ale nemôžete piť, kým neprehovoríte;
Dajte mi ho čo najskôr (v sterilnom tégliku, dajte pred lekáreň).

PLR sa môže vykonávať v akomkoľvek biologickom prostredí

Metóda PLR nezasahuje do „krvožíznivosti“, využíva biologické médium na zabránenie prenosu infekčných agens. vybrať – čo je potrebné vziať na ďalšie vyšetrenie, pošleme lekárovi.

Týmto spôsobom pri hľadaní poplachu môžete okrem analýzy krvi (hoci môžeme tiež pristupovať a vo väčšine prípadov postupovať súbežne s iným materiálom) vikorizovať:

(Vízia urogenitálneho traktu);
Odrezok slizníc úst, spojoviek, nosohltanu a tepien (u žien z krčka maternice a svalstva, u mužov z močovej trubice);
Slinu;
spermie;
z predného viniča;
Tkanivo placenty a plodová voda (plodová voda);
Sedimentácia (po centrifugácii), napríklad na identifikáciu typov IPSS a mycobacterium tuberculosis;
Spútum a pleurálna tekutina s rovnakou látkou;
exsudati;
Miecha, ak existuje podozrenie na infekčnú léziu centrálneho nervového systému;
Bioptický materiál (bioptat) odobratý z pečene, čreva s 12 pazúrmi, miechy atď.

Pred vyššie spomenutým by som rád dodal, že materiálu na testovanie vo všetkých prípadoch, v zoškraboch aj pri pozorovaniach, bude postačujúce, niektoré testovanie metódou PLR si nevyžaduje veľa úsilia, analýza je obmedzená na veľa Mikrolitre by sa mali odobrať z mikroskúmavky typu ependorf a poslať do Vivchennie.

Choroba a stagnácia PLR

VIL a polymerázová Lanzugova reakcia

Ak absolvujete anonymné testovanie a máte pozitívne výsledky, imunoblotovú diagnostiku treba zopakovať znova. Po potvrdení diagnózy sú pacientovi predpísané ďalšie vyšetrenia:

Na základe dodatočných imunologických reakcií absolútnych hodnôt počtu lymfocytov CD 4 (imunokompetentných buniek - T-pomocníkov alebo obličkových buniek), ktorá infekcia nás zasiahne ako prvá, po ktorej sú skonzumované ich hlavné autority nedokážu zničiť „svoje vlastné“. “a niekoho iného.” Vírus RNA, ktorý cirkuluje v krvnej plazme, sa mylne považuje za normálne bunky v tele a nereaguje na ne;
Detekcia RNA vírusu metódou PLR a distribúcia koncentrácie vírusových častíc na základe štádia, závažnosti patologického procesu a prognózy na základe rovnováhy týchto údajov. Je zrejmé, že v pláne chýba slovo „norma“, takže reakcia je vždy pozitívna a dešifrovanie digitálnych hodnôt patrí do kompetencie lekára.

PLR a hepatitída

Metóda PLR môže odhaliť hepatitídu, najčastejšie sa test používa na diagnostiku hepatitídy, ktorá sa inými metódami zle diagnostikuje.

Za jeho správanie v ľudskom tele je zodpovedný vírus hepatitídy C (RNA). Zaklinený v genóme pečeňových buniek (hepatocytov) tam zostane v správnom čase, ktorý môže prísť buď o 2 roky alebo o 20 rokov, takže ho lekári nazývajú „mŕtvy zabijak“. Hepatitída C vedie k rozvoju malígneho procesu v pečeňovom parenchýme, ktorý sa prejavuje v neskorších štádiách. Imunitný systém toto všetko neoznačí, pričom si vírus pomýli s hepatocytom. V mnohých prípadoch sa však vytvárajú protilátky proti vírusu, ktoré nechránia imunitný systém. Na diagnostiku ELISA na hepatitídu C nie je veľmi informatívna, pretože naznačuje, že vírus stratil stopy a či je sám infikovaný, nie je známe. V prípadoch infekcie HCV dochádza k samovyhasnutiu, pretože protilátky proti vírusu sa strácajú a naďalej cirkulujú navždy (imunologická pamäť). PLR výrazne predchádza tvorbe protilátok a dokáže detekovať vírusovú časticu v priebehu 1-1,5 dňa, zatiaľ čo AT sa môže objaviť v intervaloch 2 mesiacov pred pôrodom.

PLR diagnostika v prípadoch podozrenia na šírenie vírusu hepatitídy C v ľudskom organizme je najoptimálnejšou metódou vyšetrovania, pretože prítomnosť „právneho nepriateľa“ je možné rozpoznať len v biopsii krvi alebo pečene pacienta enta. .

Niekedy však môže dôjsť k záchvatu, ak je AT pozitívny a výsledok PLR je negatívny. Táto metóda sa používa, keď má vírus veľmi nízku intenzitu alebo keď sa „v nečinnosti“ dostane do pečene bez toho, aby sa dostal do krvného obehu. Aby sme poznali pravdu, vykoná sa opakovaná analýza od pacienta, alebo dokonca viac ako jedna.

Infekcia papilomavírusom

Pretože nemôže dôjsť k samoinfekcii, je tiež možné, bez toho, aby sa niečo ukázalo, dlho zotrvať v tele vládcu, ktorého nepodozrievam z ceny, pretože fragmenty PLR neboli vyvinuté, a príznaky choroby boli denne. Prítomnosť papilomavírusovej infekcie, či už latentnej alebo latentnej, však nie je pre zdravie človeka ani zďaleka dobrá a obzvlášť nebezpečné je mať v sebe typ vírusu, ktorý spôsobuje rakovinu (typy 16, 18).

Najčastejšie trpí IDP polovica populácie, keďže vírus častejšie postihuje ženskú časť tela a najmä krčok maternice, kde rôzne typy vírusov spôsobujú rozvoj dysplastických procesov a následne rakovinu krčka maternice, ako napr. netolerovať dyspláziu a dať vírusu voľný priebeh. Takže os, polymerázová Lanzugova reakcia odhaľuje vírusovú DNA a potom sa v tele ženy usadí buď „zlý“ alebo „dobrý“ (onkogénny alebo neonkogénny).

Iné infekcie IPSS a TORCH

Je zrejmé, že polymerázová Lanczugova reakcia dokáže odhaliť akúkoľvek cudzorodú štruktúru, ktorá vzniká z nukleových kyselín, takže test je vhodný na identifikáciu všetkých infekcií SPS a TORCH, ktoré nie sú vždy detekované. Je možné vykonať také drahé vyšetrenia na identifikáciu gonokoka, ktoré sú dostupné a lacnejšie?

Infekcie TORCH a IPSS sú vzájomne prepojené, preto je dôležité určiť, ktorá skupina by mala byť k sebe priradená. Môže byť pre nich ťažké dospieť, pretože nebudú vystavené rôznym skupinám mikroorganizmov, ktoré môže štát prenášať buď len pre mladých ľudí (imunodeficiencia), alebo sa môžu stať menej zaujímavými pre dôležitosť možnej negatívny príliv počas tehotenstva a tehotenstva.

PLR je hlavnou metódou na zisťovanie získaných infekcií

Vývoj klinických prejavov je založený na rôznych faktoroch, ktoré sú determinované silou iba PLR, čo sú hlavné úlohy, tak pri ELISA, ako aj pri ako jediný potvrdzujúci test, najmä na príznaky choroby. Takúto zložitú situáciu môže spôsobiť polymikrobiálna infekcia, ktorá okrem zjavných ochorení zahŕňa aj duševné patogény.

Ureaplazma sa najčastejšie pozoruje u párov s mykoplazmou. nie je to pre nič za nič. Tieto druhy, podobne ako chlamýdie, nie sú ani vírusmi, ani baktériami, žijú uprostred buniek a môžu byť spojené s IPSS, hoci ich prítomnosť v zdravom tele tiež nie je ani zďaleka nezvyčajná. Takže na odstránenie zdravého nosa od chorého človeka sú potrebné špeciálne metódy a PLR sa považuje za najspoľahlivejšie, berúc do úvahy zvláštnosti správania týchto mikroorganizmov atď., a výskumy sa považujú za neúčinné.

O čo ide (typ 1, 2) a čo sa týka aj herpesvírusu (typ 5), potom je tu situácia nejednoznačná. Infekcia populácie Zeme sa blíži k 100%, preto je v tomto období veľmi dôležité identifikovať vírus a jeho dávku, ktorá hrá rolu najmä pri virulencii a dokonca aj u dospelých je vírus Žije v jeho tele. často sa nevzdáva smädu a nedáva známky choroby.

Preto by ste na takúto reakciu nemali ignorovať lekársky predpis a dokonca aj v niektorých prípadoch je polymerázová Lanzugova reakcia povinnou a nevyhnutnou metódou laboratórnej diagnostiky, ktorá môže chrániť nielen pred vážnymi komplikáciami. akoby sa ešte ani nenarodila.

Radi by sme pochopili, že taká zázračná metóda ako PLR slúži ľudstvu už vyše 30 rokov. Pri tomto teste by sa človek nemal obmedzovať rizikom infekčných chorôb. Polymerázová Lanzugova reakcia, popularizovaná v oblasti molekulárnej biológie, je neoddeliteľne spojená s genetikou. úspešne kontaktuje kriminalistu, aby identifikoval konkrétnu osobu, v lodnej medicíne pre zriadenie veterinárnej medicíny, vo veterinárnej medicíne, ako klinika pre zvieratá môže kúpiť majetok na cestách, ako aj v iných oblastiach (priemysel, vidiecka vláda atď.).

Video: PLR - podstata tej stagnácie

Genetika baktérií Informácie pre inú činnosť.

Polymerázová Lanzugova reakcia

Polymerázová Lanczugova reakcia je metóda, ktorá umožňuje veľké zvýšenie (amplifikáciu) množstva molekúl DNA v analyzovanej vzorke (vrátane biologického materiálu alebo čistej kultúry).

Hlavnými výhodami PLR ako diagnostickej metódy v mikrobiológii sú veľmi vysoká citlivosť, ktorá umožňuje detekciu extrémne nízkych koncentrácií patogénov vo vzorkách, ako aj regulovaná špecifickosť, ktorá umožňuje detekciu buď Identifikovať tvory na generických, druhových alebo poddruhových úrovni. Hlavná časť PLR je spôsobená jej vysokou citlivosťou - vzorky môžu ľahko kontaminovať DNA z pozitívnej kontroly alebo produktu PLR, čo povedie k negatívnej pozitívnej reakcii. To kladie prísne obmedzenia na myslenie, v ktorom sa miešanie PLR a práca s hotovými výrobkami PLR vykonáva.

Vykonal PLR. Pripravuje sa reakčná zmes, v ktorej sa kombinujú tieto zložky:

Videl som DNA zo sledovanej vzorky,

Buferný Rozchin

Mg2+ ióny (potrebné pre enzým),

Dva priméry sú jednovláknové krátke molekuly DNA (najčastejšie 18 až 24 nukleotidov dlhé), komplementárne ku koncom rôznych DNA sekvencií, ktoré sa detegujú.

Sumite deoxynukleotid trifosfáty.

Tepelne odolná DNA polymeráza (najčastejšie vikorizovaná Taq polymeráza – polymeráza videná v Thermus aquaticus).

Potom je možné túto reakciu umiestniť do zosilňovača, ktorý je vlastne naprogramovaný termostatom. V zosilňovači sa vykoná 30-40 cyklov zmien teploty. Koža z týchto cyklov pozostáva z troch štádií (oddiel Obr. 1):

Denaturácia (teplota 94°W) – vodné dýzy prasknú a DNA sa rozchádzajú.

Priméry klesli (teplota je okolo 50-60°C) – priméry sa pridávajú na konce sekvencií DNA. Medzitým pri nízkych teplotách je vzostup výstupných reťazcov DNA zo sledovaného fragmentu (renaturácia) energeticky priaznivejší, vzhľadom na koncentráciu primerov v reakčnej zmesi o mnoho rádov.V závislosti od koncentrácie DNA v sekvencie (napríklad na Cob cykloch PLR), reakcia primérov pokračuje s poklesom DNA. Teplota topenia sa volí na základe teploty topenia (denaturácie) primérov.

Predĺženie (teplota 72 °C) – DNA polymeráza vytvára primery dlhej matrice DNA. Teplota udáva optimálnu teplotu na produkciu vikorizovanej DNA polymerázy.

Detekcia výsledkov sa líši v rôznych verziách PLR a je popísaná v časti „Typy PLR“.

Dynamika PLR

V skorých PLR cykloch množstvo dvojitých molekúl DNA, ktorých veľkosť je určená polohou medzi miestami pristátia priméru, interaguje s kožným cyklom. Týmto spôsobom sa vytvorí malý počet existujúcich molekúl DNA, ktoré možno extrahovať (div. obr. 2).

V skorých cykloch je teda sila produktu PLR opísaná vzorcom m*2 n, kde m je výťažok vzorky DNA, n je počet cyklov. Potom reakcia dosiahne plató. K tomu dochádza akumuláciou reakčného produktu, znížením koncentrácie primérov a deoxynukleotidtrifosfátov, ako aj zvýšením koncentrácie pyrofosfátu (obr. 3).

Riznovidi PLR

Konvencia PLR

V tejto verzii PLR reakcie sa potom zvolí počet cyklov (30-40), po ktorých sa analyzuje, či sa v reakčnej zmesi nahromadila akumulácia molekúl sopečnej DNA.

Táto možnosť stagingu PLR v prípade kŕčových žíl ako diagnostická metóda je jasná metóda. Pozitívna reakcia naznačuje prítomnosť stôp molekúl DNA, ktoré sa nachádzajú na obrázku. Negatívna reakcia na informovanie o jeho existencii. Kvantitatívne hodnotenie výstupných molekúl DNA je nemožné prostredníctvom reakcie na plató.

Hlavnou metódou identifikácie produktu je elektroforéza na agarózových alebo polyakrylamidových géloch. Produkty PLR sú oddelené v géli pod elektrickým poľom, aby sa znížila ich molekulová hmotnosť. Gél obsahuje interkalačný dráč (fluorescenčný v DNA-naviazanom stave - najčastejšie bromid etid). Po vystavení ultrafialovému svetlu bude teda možné zistiť prítomnosť alebo prítomnosť značky, ktorá označuje DNA požadovanej molekulovej hmotnosti. Počas hodiny vykonávania PLR na diagnostické účely sa vždy zavedie pozitívna a negatívna kontrola reakcie, čo vedie k rovnakým príznakom (oddiel obr. 4).

PLR v reálnom čase

V tejto verzii výroby PLR sa sila produktu PLR v reakčnej zmesi zaznamenáva nepretržite v priebehu reakcie. To umožňuje vygenerovať reakčnú krivku (oddiel Obr. 3) a na základe nej extrahovať z častíc množstvo rôznych molekúl DNA.

Jedným z typov PLR realizovaných v reálnom čase je použitie vikoristického interkalačného činidla, ktoré sa pridáva priamo do reakčnej zmesi (najčastejšie vikoristický SYBRGreen). Ďalším typom je použitie jedného z typov fluorescenčných sond, ktoré sú zapojené do priestoru v strede PLR® produktu, čo umožňuje zvýšiť špecificitu detekcie (oddiel obr. 5). Fluorescenčná detekcia sa vykonáva kontinuálne počas reakcie.

Okrem možnosti rýchlej detekcie sú v súlade s konvenciou odhalené ďalšie výhody PLR v reálnom čase. Táto verzia PLR je jednoduchšia, rýchlejšia a tiež nevyžaduje otváranie skúmaviek s produktmi PLR, čo znižuje kontamináciu inými časticami. Hlavnou nevýhodou je vyšší výkon zosilňovača vďaka zvýšenej schopnosti detekcie fluorescencie oproti originálu.

Digitálna Kilkisna PLR

Nový, drahý a stále málo široký variant PLR, ktorý umožňuje presnejšie určiť silu DNA vo vzorke. V tejto verzii je reakcia zmesi, ktorá obsahuje fluorescenčný barnberry, rozdelená do veľkého počtu mikroskopických objemov (napríklad kvapiek v emulzii). Po absolvovaní PLR sa analyzuje, ktorá časť kvapiek má pozitívnu reakciu a zjavne sa pozoruje fluorescencia. Táto časť bude úmerná počtu molekúl DNA nájdených u každého jednotlivca.

PLR z reverznej transkripcie

Pred touto alebo inou verziou PLR je inhibovaná reakcia reverznej transkripcie (RNA na DNA) pomocou enzýmu revertázy. Táto metóda teda umožňuje presnú identifikáciu molekúl RNA. To môže byť použité na detekciu RNA vírusov alebo na určenie úrovne transkripcie (mRNA) konkrétneho génu.

Malyunok 1. Etapi PLR. Základné nátery sú označené červenou farbou.

Malyunok 2. Akumulácia dvojitých molekúl DNA, obklopených primérmi, počas PLR.

Malyunok 3. Dynamika PLR reakcie pri rôznych koncentráciách molekúl DNA nachádzajúcich sa vo vzorke. (a) – najvyššia koncentrácia (b) – stredná koncentrácia (c) – najnižšia koncentrácia

Malyunok 4. Agarózová elektroforéza produktov PLR. K+ - pozitívna kontrola (za prítomnosťou DNA, ktorá sa zisťuje). 1-7 - ďalšie stopy (z toho 1-2 sú pozitívne, 3-7 - negatívne). K-negatívna kontrola (video DNA sukana DNA). V mnohých prípadoch je okrem celého produktu viditeľných viac svetelných nešpecifických reakčných produktov (primérových dimérov).

Malyunok 5. Metódy detekcie pod hodinou vikoristnya PLR v hodine. (a) – interkalovaný barnberry – fluoreskuje pri naviazaní na dvojvláknovú DNA (b) – Taqmanova sonda – fluorescencia nastáva, keď je DNA sonda štiepená DNA polymerázou s 5'-3' endonukleázovou aktivitou pre hendikep fluorescenčnej membrány a zhášač. (c) – Sonda MolecularBeacon - fluorescencia sa objaví počas hybridizácie sondy s celým fragmentom mimo priestoru vzdialeného fluorofóru a zhášadla (d) – Sondy LightCycler - fluorescencia akceptora sa objaví počas hybridizácie sond prenášaných nya (FRET).

Polymerázová reťazová reakcia (PLR, PCR – polymerázová reťazová reakcia) je metóda na odstránenie anonymných kópií fragmentov DNA (génov) z biologického vírusu.

Podstata PLR ako metódy molekulárnej biológie spočíva vo veľkej vzorkovej kópii génu piesne (DNA extension) pomocou špeciálnych enzýmov v mozgu. in vitro. Dôležitou vlastnosťou PLR je odstránenie kópie konkrétneho kusu DNA (génu), ktorý zodpovedá danej mysli. Synonymom pre proces kopírovania DNA je „amplifikácia“. replikácia DNA in vivo Môžete tiež použiť zosilnenie. V dôsledku replikácie sa však počas Lancugovej polymerázovej reakcie amplifikujú krátke úseky DNA (maximálne 40 000 nukleotidových párov).

Základné princípy

PLR je tiež karbonázové kopírovanie fragmentov DNA in vitro počas teplotných cyklov, ktoré sa opakujú. Ako prebieha reakčný proces v rámci jedného teplotného cyklu?

Syntéza nukleotidovej lance sa uskutočňuje enzýmom DNA polymerázou. Aby však klas fungoval, enzým potrebuje štartovaciu platformu. Podobne ako Majdany, aj „primery“ (semená) pôsobia ako syntetické oligonukleotidy s celkovým počtom 15-20 nukleotidov. Existujú dva priméry (dopredný a reverzný), sú komplementárne k úsekom templátu DNA a samotný fragment DNA, obklopený primérmi, je kopírovaný DNA polymerázou. Práca polymerázy spočíva v postupnom pridávaní nukleotidov komplementárnych k sekvencii templátu DNA. Tim sám v jednom teplotnom cykle opäť syntetizuje dva nové fragmenty DNA (keďže molekula DNA je Dolantsyuzhkova, potom existujú dve matrice). Počas 25-35 cyklov teda vzorka nahromadí miliardy kópií grafu DNA identifikovaného primérmi. Štruktúru uzavretého cyklu možno znázorniť takto:

denaturácia DNA (topenie, rozpad lancie DNA) – 95°C – 1 alebo 2 hvilín;
pokles primérov (priméry sa viažu na templát DNA, teplota tohto štádia je určená zložením nukleotidov priméru) - 60 ° C (napríklad) - 1 hvilina;
Predĺženie DNA (polymeráza syntetizuje DNA) - 72°C - 1 hodina (ponechať hodinu, kým sa fragment nesyntetizuje).

Praktický základ pre testovanie metódy polymerázovej Lanziugovej reakcie v laboratóriu musí pozostávať z:

(alebo ako sa inak nazýva tepelný cyklovač);
systémy pre s (pre vizualizáciu výsledkov PLR);
systémy (na analýzu výsledkov PLR);
(Na prípravu vzorky);
súprava (mechanická a elektronická).

Okrem hlavného a pomocného vybavenia pre plné fungovanie laboratória PLR sú potrebné materiály: sterilné hroty, skúmavky, stojany na skúmavky a dávkovače.

Reagenčná báza vo východiskovom laboratóriu PLR na uskutočnenie plnohodnotnej polymerázovej Lancugovej reakcie zahŕňa enzým DNA polymerázu s pufrom, priméry (malé syntetické fragmenty DNA komplementárne ku kmeňu a koncu analyzovaných úsekov matrice DNA), súčet nukleotidy (A, T, G, C). Bezpodmienečne potrebná je aj čistená voda.

Výhody metódy PLR

Vysoká citlivosť vyšetrovania

Citlivosť metódy je taká, že amplifikáciu PLR a identifikáciu cieľovej sekvencie možno dosiahnuť v prípade, že sa vyskytuje raz za 5 buniek.

Špecifickosť analýzy

PLR umožňuje detegovať DNA špecifického infekčného agens v prítomnosti DNA iných mikroorganizmov a DNA hostiteľského organizmu, ako aj vykonávať genotypizáciu. Špecifickým výberom reakčných zložiek (primérov) môžete okamžite odhaliť DNA príbuzných mikroorganizmov.

Všestrannosť metódy PLR

Vpravo pre diagnostiku PLR infekčných chorôb a nákazlivých chorôb u ľudí možno použiť rovnaké znalosti, dodržiavať univerzálne postupy na prípravu vzoriek (vzoriek) a vykonávanie analýz, ako aj podobné súpravy reagencií.

Úspora času

Dôležitou výhodou PLR je množstvo etáp kultúrnej mikrobiologickej práce. Príprava vzoriek, vykonávanie reakcií a analýza výsledkov maximálnej úľavy a veľa automatizácie. V každom prípade môžu výsledky rýchlo klesnúť na 4-5 rokov.

Účinnosť metódy PLR

Šírka študovaného klinického materiálu

V dôsledku polymerázovej Lanczygovej reakcie je možné z choroby odstrániť nielen biologický materiál, ale aj množstvo ďalších substrátov, v ktorých možno identifikovať molekuly DNA s vysokou únavou, napríklad voda, pôda, potraviny, mikroorganizmy , a oveľa viac.

Všetky najdôležitejšie výhody tejto unikátnej metódy sú vysoká senzitivita a špecifickosť, identifikácia infekčného agens a genotypizácia akéhokoľvek ľudského génu, vysoká účinnosť a úspora času, univerzálnosť Neexistuje žiadny praktický základ – súčasná metóda PLR môže byť široko používaná v klinickej diagnostike , lekárska prax a vedecký výskum a bohatstvo v iných oblastiach.

Zastosuvannya PLR

Oblasti stagnácie polymerázovej Lancugovej reakcie v dôsledku súčasnej metódy molekulárnej biológie sú rôzne. Je bohatá na šírku materiálu, ktorý je možné analyzovať (predmetom skúmania môže byť takmer všetko, z čoho možno jasnejšie vidieť DNA), ako aj na vybrané priméry. Hlavné oblasti implementácie PLR:

klinickej medicíny

ekológia

sledovanie vývoja dovkilla
analýza potravinárskych výrobkov
analýza geneticky modifikovaných organizmov (GMO)

lodné lekárstvo a súdne lekárstvo

Individuálna identifikácia
založenie vlasti

farmakológie

veterinárna medicína

vedecký výskum (molekulárna biológia, genetika)

Organizácia laboratória PLR

Informácie pre uzatváranie zmlúv

názov	O nás	Virobnitstvo	Metóda	Kat.č.

PLR - diagnostika infekcií, okamžitá a vysoko presná metóda zisťovania rôznych infekčných ochorení. Aký je rozdiel medzi inými analýzami?

Táto skratka sa dešifruje ako polymerázová Lanzugova reakcia. Podľa Wikipédie sa Keri Mullis narodila v roku 1983 v americkej histórii. Za jeho prínos mu bola odmietnutá Nobelova cena.

Naposledy PLR zvíťazila iba pomocou vedeckej metódy, po ktorej bola úspešne založená medicínou. Podstata vyšetrovania spočíva v rozpoznaní pôvodcu infekcie na základe DNA a RNA. Kožné ochorenie, ktoré preniká do DNA, mení svoju štruktúru na iný typ. Pri samotnom pohľade na zmenenú DNA si laboratórny asistent uvedomí, ako sa choroba vyskytuje u ľudí. Medzi ďalšie výhody PLR:

Identifikácia primárnej príčiny infekcie, ktorá stratila „stopu“ v DNA. Keď sa zistí veľa chorôb, je dôležité identifikovať tie, kde to všetko začalo. A pre správnu diagnózu a výber účinnej liečby má Lanzugova reakcia obrovský význam;
Inštaluje sa na PLR, pretože DNA bola zmenená a v špecifickom štádiu transformácie. Je to potrebné na vylúčenie pochybných infekcií;
PLR diagnostika je citlivá a detekuje prítomnosť jednotlivých baktérií a vírusov. Po nesprávne predpísanom kúpeli alebo neplánovanom prerušení kúpeľa sa môžu smrady stratiť v krvi. Minimálne množstvo diagnostikované pri dekódovaní PLR je 10 klientskych dní. Ostatné testovacie metódy sú menšie;
Patogénne mikroorganizmy sa zisťujú v závislosti od prejavu symptómov PPSS. Choroba zistená v počiatočnom štádiu netrvá tak dlho ako pokročilá forma;
Výsledky PLR chorôb sa vezmú do rúk, aby sa to rýchlo skončilo. Diagnostika infekcií trvá o niečo viac ako 4-6 rokov. Spolu s dešifrovaním trvá celý proces o niečo viac ako 1-2 dni;
Naraz sa extrahuje materiál DNA na vykonanie 5-6 testov. Chorý človek nebude mať príležitosť mnohokrát podstúpiť šmuhy;
PLR a sledovanie infekcií nestoja, táto oblasť sa neustále rozvíja. S objavením nových testovacích systémov so zvýšenou citlivosťou sa znižuje pravdepodobnosť vykonania sledovania. Keďže predtým bol dostupný iba pre obyvateľov megacities, teraz si lekári na nemocničných klinikách v regiónoch bez neho nevedia predstaviť liečbu chorôb.

Vlastnosti metódy PLR:

Presnosť (opravy sú minimálne a ich frekvencia nepresahuje 0,01%);
Citlivosť (test „počíta“ jednotlivé baktérie v krvi a náteroch);
Špecifickosť (PLR detekuje infekcie, ktoré sa často neprejavia až do dôležitej fázy);
Jedinečnosť (analýza výsledkov v situáciách, keď iné vyšetrovania nič neodhalia).

Výsledky analýzy PLR

Ako funguje Lanzugova reakčná metóda a ako sa pripravujete pred analýzou?

Lanzugova reakcia v laboratórnych mozgoch prenáša násobenie bohatých grafov DNA a RNA identifikáciou rovnakej poškodenej časti. Kyseliny sa amplifikujú (konjugujú) pomocou enzýmových prípravkov. Laboratórny asistent pomocou vikoristických enzýmov odstráni dostatočné množstvo kópií patogénneho fragmentu DNA, aby zosúladil PLR so symptómami týchto a iných ochorení vyvolaných infekciou.

Spravidla sa testujú biologické materiály odobraté odberom vzoriek alebo náterom. Na identifikáciu (dešifrovanie sexuálne prenosných infekcií) sa odoberie náter z epidermis, krčka maternice alebo maternice na PLR. Niekedy bojujú aj vikoristi.

Na potvrdenie alebo zistenie prítomnosti hepatitídy, toxoplazmózy alebo HIV odoberte krv zo žily. Krv odobratá z prsta často dáva mliečne negatívne výsledky. Mononukleóza je diagnostikovaná po odbere materiálu z hrdla mulíc. Tuberkulózu možno zistiť po odbere spúta, čo je jasne vidieť u pacientov s ranami.

Náter z maternice a krčka maternice pre PLR je jednoduchá analýza, nie je s ňou žiadna hlúposť. 2-3 dni pred podujatím budete vyzvaní, aby ste žili formálnym životom. V súčasnosti sa na špeciálnu hygienu používajú gély a mlieka na prírodnej báze. Môžete piť teplú vodu z vodovodu. Zastavte umývanie - večer pred ranou do laboratória alebo ordinácie.

Dôležitá je aj liečba drozdov pomocou krémov, mastí, čapíkov a sprejov, ktorá sa vykonáva. Náter sa odoberá z prvej panvy buď po menštruácii alebo bezprostredne po nej. Na získanie presných výsledkov sa odporúča nechodiť na záchod 2-3 roky pred odberom PLR náteru.

U ľudí, ktorí majú Lanziugovu reakciu, sa odoberie tampón z močovej trubice. Biologický materiál sa odoberá pomocou sterilnej sondy alebo vatového tampónu, ktorý sa zavedie do semena. Počas hodiny procedúry môžete pociťovať mierne nepohodlie alebo opuch pečene. Ľudia musia tráviť veľa času aj učením sa o sexe a hygiene. Obdobie pred analýzou je predpísaná liečba antibiotikami a inými liekmi. Ak po odbere pretrvávajú nepríjemné pocity, odporúča sa čo najskôr ísť na kliniku.

Je prijateľné, aby pacient podstúpil krvné testy alebo ster z orgánov pacienta. Genetický materiál sa umiestni do PLR amplifikačného zariadenia a tam sa pridajú enzýmy. DNA sa zahrieva na 90-95 °C, kým sa šnúrka nesformuje do špajle. Tento proces sa nazýva denaturácia. Počas hodiny prevádzky reaktora sa z jednej vzorky DNA a RNA vytvoria tisíce kópií na analýzu (dešifrovanie reakcie).

Výsledky diagnostiky PLR

Lanzugova reakcia ukazuje závažnosť infekcie a presne počet zjavných komplikácií. Rozlúštenie zostávajúcich hornín je individuálnym zavedením mutačných génov do ľudskej DNA s cieľom odhaliť schopnosť zmeniť genotyp.

Čo prezrádza diagnóza infekcie PPR?

Dekódovanie výsledkov analýzy je jasne viditeľné pre kvalifikovaného lekára. Sila Lanczygovej reakcie nám umožňuje potvrdiť alebo zistiť prítomnosť týchto chorôb:

Ako je zrejmé z tohto zoznamu, diagnostika PLR poskytuje lekárom širokú škálu vysoko špecializovaných odborností bez obmedzených schopností. Metódu možno využiť v pneumológii, virológii, infekčných chorobách, onkológii, gastroenterológii, hematológii, gynekológii a urológii.

PLR dešifrovanie: výsledky

Analýzy Lancugovej reakcie posudzujú lekári individuálne pre kožného pacienta so zjavnými patológiami a chronickými ochoreniami. Výsledky analýz PLR naznačujú, ako bolo uvedené vyššie, špecifické vlastnosti patogénnych baktérií. Pri ich riešení lekár určí stupeň závažnosti a štádium ochorenia. Na základe týchto ukazovateľov je ďalej indikované dávkovanie liekov a trvanie liečby.

Negatívny výsledok PLR znamená, že zozbieraný biologický materiál vykazuje každý deň akékoľvek vírusy alebo infekcie. Pozitívny PLR je signál pred poplachom. Tiež bola zistená infekcia v krvi a iných biologických oblastiach pacienta.

Ak sú hodnoty minimálne, môžete hovoriť o jednoduchej prítomnosti choroby, nielen o aktívnom vývoji choroby. Jednoduchý nosič infekcie, ktorá sa prejaví len PPR, no nevykazuje bežné iné príznaky, musí byť neustále konzultovaný s lekárom.

Je dôležité nepodliehať panike a pamätať si, že väčšina vírusov, ktoré veda pozná, sa dá liečiť antibakteriálnymi liekmi. Ich výber a nahradenie jedného za jeden v prípade neúčinnosti môže zbaviť kvalifikáciu lekára, o čom svedčí aj liečba tejto a iných chorôb.

Dešifrovanie PLR sa môže vykonávať nielen podľa uváženia lekára, ale aj podľa uváženia orgánov. Často sa bojíme žien, ktoré plánujú v blízkej budúcnosti otehotnieť, aby sme sa vyhli možnosti pohlavných chorôb. Pri umiestnení na regionálnej konzultácii s pacientom nie je potrebná dôkladná diagnostika.

PLR sa predpisuje povinným ženám, ktoré podstúpili malý počet potratov alebo potratov z rôznych dôvodov. Pred EBC sa vykoná analýza na identifikáciu všetkých príčin možného vypudenia oplodneného vajíčka.

Ľudia často vykonávajú PLR po prepustení, počas hodiny akejsi dovolenkovej romantiky alebo svadby. Diagnostika im pomáha neohrozovať svoj život a zdravie potenciálnych sexuálnych partnerov.

PLR je často jedinou šancou pre pacienta na zotavenie sa z choroby v embryonálnom štádiu, ak je zbytočné riziko komplikované náročnou cestou.

Náter s použitím metódy PLR na diagnostiku infekčných chorôb sa môže stať dôležitejším:

Priama diagnostika infekčných chorôb a chorôb.

Mnohé tradičné metódy laboratórnej diagnostiky sa spoliehajú na detekciu každodenných chorôb pre rôzne nepriame príznaky. Napríklad diagnostika ELISA je založená na proteínoch detekovaných v krvi pacienta, ktoré sú produktmi rozkladu infekčných agens, na základe ktorých môže lekár stanoviť ďalšiu diagnózu. Metóda analýzy PLR poskytuje priamu indikáciu prítomnosti špecifickej vzorky DNA choroby v materiáli odobratom od pacienta.

Vysoká špecifickosť diagnostiky PLR.

Počas procesu analýzy skúmaný materiál odhalí fragment DNA, ktorý je špecifický a má silu pre konkrétny organizmus – buď baktériu alebo vírus. Tento kúsok DNA je jedinečný a nie je typický pre infekciu zvierat na Zemi.

Vysoká citlivosť PLR.

Infekcie sa môžu vyskytnúť, ak materiál odobratý pacientovi obsahuje menej ako jednu bunku baktérie alebo vírusu. Porovnateľné s inými imunologickými a mikrobiologickými diagnostickými metódami: citlivosť analýzy PLR – 10-100 buniek na vzorku, ostatné metódy – 103-105 buniek.

0Pole (=> Analýzy) Pole (=> 2) Pole (=>.html) 2

Všestrannosť analýzy PLR.

Na vyšetrenie PLR je možné použiť prakticky akékoľvek materiály, ktoré nie sú dostupné na vyšetrenie inými metódami: hlien, odrezky, krv, sérum, hlien, ejakulát, úlomky epitelových buniek a pod. Infekcia sa môže vyskytnúť v ktorejkoľvek biologickej materiály alebo tkanivá.

Existuje vysoký stupeň podpory pre výsledky analýzy PLR.

Jednotná metóda pre celé spracovanie materiálu odobraného od pacienta na analýzu, detekcia reakčných produktov, automatizovaná PLR amplifikácia umožňuje novú diagnostiku PLR za 4-5 rokov. Zároveň sa oveľa viac ako hodina strávi kultúrnymi metódami pozorovania - od mnohých dní po mnoho dní, pretože je potrebné vidieť a potom vyvinúť patogén na bunkovej kultúre.

Možnosť diagnostiky akéhokoľvek typu infekcie.

Vysoká citlivosť metódy PLR umožňuje diagnostikovať infekciu nielen v akútnom štádiu ochorenia, ale aj odhaliť chronické infekcie a identifikovať jednotlivé baktérie a vírusy.

Náter pomocou metódy PLR umožňuje odhaliť infekcie, ktoré sa nedajú zistiť náterom z flóry: chlamýdie, ureaplazmóza, mykoplazmóza, genitálny herpes.

Aké sú významné výhody vyšetrovacej metódy a diagnostiky PLR? Medzi nedostatky diagnostiky PLR patria:

Možnosť získať pozitívny výsledok

Analýza PLR môže ukázať pozitívny výsledok, ak je infekcia už mŕtva, „zabitá“ antibiotikami a mŕtve bunky sa stále nachádzajú v tkanivách pacienta. Ako je to možné? Celkom jednoduché. Napríklad infekcia žije v tkanivách epitelu (na sliznici orgánov alebo očí). Obaja si to užívali. „Obnova“ epitelu buniek trvá hodinu. Ak je materiál odobratý lekárom pred úplnou obnovou buniek, materiál môže obsahovať odumreté bunky infekcie. Klitini samozrejme odstraňuje genetický materiál - DNA alebo RNA z tela, čo si myslí PLR. PLR neoddeľuje mŕtve bunky od živých: hľadá DNA a „klonuje“ ich vo veľkom počte. Výsledok takejto analýzy je pozitívny. V skutočnosti je pravda, že sme hybnopozitívni.

Neschopnosť PLR „zotaviť“ mŕtvu infekciu zo živej sťažuje detekciu PLR a kontrolu účinnosti liečby. Hlavným pravidlom je samozrejme zabezpečiť úplné vylúčenie mŕtvych prebytkov infekcie z tela, ktoré priemerný človek prežíva 4-8 rokov. Preto po užití zvyšných tabliet antibiotík môže a mala by sa použiť metóda PLR na sledovanie účinnosti liečby.

gastroenterológia diagnostický komplex - 5360 rubľov

TILKI IN BEREZNY úspory - 15%

1000 rubľov Načítanie EKG z dekódovania

- 25%primárny
navštívte lekára
terapeut cez víkendy

980 rubľov. prvé stretnutie s hirudoterapeutom

stretnutie s terapeutom - 1130 rubľov (striedavo 1500 rubľov) „Len cez týždeň, v sobotu a týždne, návšteva terapeuta s 25% zľavou - 1130 rubľov namiesto 1500 rubľov (diagnostické procedúry sa platia podľa cenníka)

V neskoršom štádiu môže byť kontrola zakazovania vykonaná inou kultúrnou metódou alebo výsevom: iba živé mikroorganizmy, ktoré sa rozmnožujú, môžu slúžiť ako znak nenásilia.

Na diagnostiku gardnerelózy sa neodporúča používať analýzu PLR, pretože gardnerelli - pacienti s týmto ochorením v malom počte prípadov bežne žijú v pôde. DNA týchto baktérií s vikoristickým PLR sa čoskoro stratí. Gardnerella sa v nátere neprejavuje a bakterioskopia je v tomto prípade dostatočnou metódou na diagnostiku gardnerelózy a sledovanie liečby.
Rozmanitosť mikroorganizmov

Každý mikrób sa môže zmeniť a súčasne s DNA. Najkrajší zadok z tohto galusa je vírus chrípky. Keď bol človek raz chorý, vytvorí si protilátky proti vírusu. Čisto teoreticky, ak sme čo i len raz ochoreli na chrípku, tak rovnako ako pri chrípke nie je naša chyba, že ochorieme znova. Skoro nás bolí hrdlo. Aky je dôvod? Vírus „mutuje“, mierne „mení“ svoj genóm a náš imunitný systém, naše protilátky už „nerozpoznávajú“ starého hosťa v novom vzhľade. Nie je to šialené, že som znova chorý na chrípku...

Pri navrhovaní zosilňovača (testovací systém PLR) sa vyberie fragment DNA špecifický pre daný mikroorganizmus, ktorý je najmenej náchylný na zmenu. Je „vybraný“ z takzvanej vysoko konzervatívnej časti DNA. Alternatívne môže nadbytok mikroorganizmov viesť k tomu, že určité genotypy alebo kmene pozorovaného organizmu môžu spôsobiť mutácie v genóme, ktorý sa amplifikuje (klonuje) a stáva sa tak nepolapiteľným daným testovacím systémom.

Rozdielne testovacie systémy sú teda jedným z dôvodov, prečo analýzy vykonané v rôznych laboratóriách a na rôznych klinikách pomocou rovnakej metódy PLR môžu ukázať diametrálne odlišné výsledky. Aby sme sa čo najviac vyhli mutáciám, teraz boli vyvinuté normy na reguláciu testovania (vrátane testovania krížových reakcií, ako aj testovania indikovaných kmeňov v domácnostiach), čo si vyžaduje systém testovania, čo je prvá vec, ktorú treba uviesť na trh a Bude Vicoristan slúžiť na diagnostiku vášho zdravia Prečo dobré kliniky a laboratóriá používajú Vicoristan pre zostávajúce generácie testovacích systémov. A naše medicínske centrum „Euromedprestige“ je jedno z mála, ktoré svojim klientom dokáže poskytnúť prehľadnú diagnostiku.