rumah Pengobatan Tentang diagnosis penyakit metabolik herediter pada anak-anak dengan spektrometri massa tandem di wilayah Sverdlovsk. Masalah modern sains dan pendidikan Bagaimana mempersiapkan bayi untuk penelitian

Tentang diagnosis penyakit metabolik herediter pada anak-anak dengan spektrometri massa tandem di wilayah Sverdlovsk. Masalah modern sains dan pendidikan Bagaimana mempersiapkan bayi untuk penelitian

Spektrometri massa tandem adalah salah satu metode modern untuk analisis senyawa, yang banyak digunakan untuk berbagai keperluan ilmiah dan praktis. Metode ini memungkinkan analisis beberapa ratus senyawa dalam jumlah mikro bahan biologis. Dalam praktek pelayanan kesehatan dunia, metode ini digunakan untuk melakukan skrining massal pada bayi baru lahir untuk penyakit metabolik herediter (NBD). Di tempat darah kering, dimungkinkan untuk menentukan asam amino (termasuk fenilalanin) dan asilkarnitin. Penentuan kuantitatif zat ini memungkinkan untuk mengecualikan beberapa lusin penyakit keturunan yang termasuk dalam kelas berbeda NBO (gangguan metabolisme asam amino, asam organik, dan cacat pada oksidasi β mitokondria asam lemak). Sebelumnya, diagnosis kelainan ini membutuhkan bahan biologis dalam jumlah besar, beberapa penelitian (analisis asam amino, spektrometri kromatomassa, penentuan spektrum asilkarnitin), yang membutuhkan waktu dan biaya bahan yang signifikan. TMS memungkinkan Anda untuk mengukur semua senyawa ini dalam satu analisis! Gangguan turunan dari metabolisme asam amino, asam organik dan cacat pada oksidasi beta mitokondria asam lemak memiliki sekitar 100 bentuk nosologis, yang sebagian besar dimanifestasikan pada periode neonatal. Frekuensinya lebih dari 1: 5000 kelahiran hidup. Banyak dokter secara keliru percaya bahwa penyakit pada kelompok ini sangat jarang sehingga perlu disingkirkan hanya sebagai upaya terakhir, dan seringkali diagnosis yang benar dibuat di kemudian hari atau penyakit tersebut tidak didiagnosis sama sekali.

Selama analisis, 52 indikator ditentukan (asam amino dan asilkarnin)

4, 1

1 FSBI "Medical Genetic Research Center" dari Akademi Ilmu Kedokteran Rusia

2 Lembaga Pendidikan Anggaran Negara Pendidikan Profesional Tinggi "Universitas Kedokteran Negeri Rostov dari Kementerian Kesehatan Rusia"

3 GBUZ "Rumah Sakit Klinik Regional No. 1 dinamai menurut Profesor S.V. Ochapovsky" dari Departemen Kesehatan Wilayah Krasnodar

4 FSBI "Medical Genetic Research Center"

Untuk memperkuat pengenalan skrining massal bayi baru lahir untuk penyakit metabolik herediter (NBO) dengan spektrometri massa tandem (MS / MS), dilakukan studi retrospektif sampel darah yang diarsipkan dari anak-anak (n \u003d 86) yang meninggal pada tahun pertama kehidupan. Perubahan profil asam amino dan asilkarnitin terdeteksi dalam 4 kasus (4,7%). Di salah satunya, beberapa peningkatan konsentrasi leusin, isoleusin dan valin, yang khusus untuk penyakit bau urin sirup maple, ditemukan. Gambaran klinis dan deteksi mutasi pada ekson pertama gen BCKDHB (c.98delG) dalam keadaan heterozigot secara tidak langsung mengkonfirmasi diagnosis leucinosis. Dalam tiga kasus lainnya, perubahan yang terungkap dalam profil asam amino dan asilkarnitin tidak memiliki karakter spesifik yang sama. Dalam kasus ini, tes darah berulang dengan metode MS / MS, studi klinis dan biokimia tambahan akan diperlukan. Sebagai hasil dari penelitian tersebut, kebutuhan untuk memperkenalkan metode MS / MS ke dalam program skrining neonatal untuk NBO untuk diagnosis dan pengobatan yang tepat waktu telah dikonfirmasi.

diagnosis retrospektif

spektrometri massa tandem

penyakit metabolik keturunan

1. Krasnopolskaya KD Penyakit metabolik keturunan. Manual referensi untuk dokter. - M .: "Pusat adaptasi dan rehabilitasi sosial anak" Fohat "RPO, 2005. - 364 hal.

2. Mikhailova SV, Zakharova E. Yu., Petrukhin SEBAGAI penyakit Neurometabolik pada anak dan remaja. Diagnostik dan pendekatan pengobatan. - M .: "Literra", 2011. - 352 hal.

3. Chace H. D. Diagnosis cepat analisis kuantitatif defisiensi MCAD dari oktanoilkarnitin dan asilkarnitin lainnya pada bercak darah bayi baru lahir dengan spektrometri massa tandem / Chace H. D., Hillman S. L., Van Hove J. L. et al. // Kimia Klinis. - 1997. - V. 43. - No. 11. - P. 2106-2113.

4. Nyhan L. W., Barshop B. A., Ozand P. T. Atlas penyakit metabolik. - Edisi kedua. - London: Hodder Arnold, 2005. - 788 hal.

5. Rashed M. S. Aplikasi klinis spektrometri massa tandem: sepuluh tahun diagnosis dan skrining untuk penyakit metabolik yang diturunkan // J. dari Chrom. B. - 2001. - V. 758. - No. 27-48.

6. Sweetman L. Gangguan penamaan dan penghitungan (counditions) termasuk dalam panel skrining bayi baru lahir / Sweetman L., Millington D. S., Therrell B. L. et al. // Pediatri. - 2006. - V. 117. - Hlm.308-314.

7. Van Hove J. L. Defisiensi dehidrogenase acl-CoA rantai menengah: diagnosis dengan analisis acylcarnititne dalam darah / Van Hove J. L., Zhang W., Kahler S. G. et al. // Saya. J. Hum. Genet. - 1993. - V. 52. - Hlm 958-966.

pengantar

Hingga saat ini, lebih dari 500 bentuk nosologis penyakit metabolik herediter (NBO) telah diketahui. Sebagian besar NBO sangat jarang, tetapi frekuensi totalnya dalam populasi adalah 1: 1000-1: 5000. Sebagai aturan, NBO memanifestasikan dirinya pada tahun pertama kehidupan dengan gejala nonspesifik yang secara klinis menutupi mereka sebagai patologi somatik non-herediter lainnya. Pada saat yang sama, diagnosis penyakit keturunan metabolik yang tepat waktu penting, karena bagi banyak dari mereka, dikembangkan dan terus dikembangkan. metode yang efektif pengobatan patogenetik, yang tanpanya hasil penyakit seringkali tetap fatal. Secara umum diterima bahwa salah satu pendekatan yang paling tepat dan efektif untuk deteksi dini patologi herediter adalah skrining genetik neonatal. Perkembangan metode tandem mass spektrometri (MS / MS) dengan ionisasi elektrospray membuat skrining spektrometri massa skala besar dapat diterapkan dalam praktek pemeriksaan massa di NBO pada akhir tahun 90-an abad XX. Metode mikro yang sangat sensitif ini memungkinkan untuk secara bersamaan menentukan dalam beberapa mikroliter darah konsentrasi puluhan asam amino dan asilkarnitin, yang penting untuk diagnosis NBO. Efektivitas uji laboratorium MS / MS memungkinkan untuk memasukkannya ke dalam program negara bagian skrining neonatal bayi baru lahir untuk mengetahui aminoasidopati, aciduria organik dan defek pada oksidasi β mitokondria asam lemak di sejumlah negara. Namun demikian, di Federasi Rusia, metode MS / MS belum diperkenalkan ke dalam sistem skrining massal bayi baru lahir dan tersedia untuk skrining selektif untuk NBO hanya di pusat medis federal tunggal.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendukung secara ilmiah kebutuhan untuk memasukkan studi MS / MS untuk diagnosis aminoasidopati, acidurias organik, dan defek oksidasi β mitokondria asam lemak ke dalam program regional untuk skrining massal bayi baru lahir berdasarkan analisis spektrometri massa retrospektif sampel darah dari anak sakit yang penyakitnya telah berakhir. hasil yang mematikan di tahun pertama kehidupan.

Pasien dan metode penelitian

Studi retrospektif ini melibatkan anak-anak (n \u003d 86, rasio laki-laki: perempuan 48/38) yang meninggal pada tahun pertama kehidupan (pada usia 5 hari sampai 11 bulan kehidupan) selama satu tahun kalender (2010) di wilayah administratif Wilayah Krasnodar. ... Studi ini melibatkan anak-anak dengan kelainan bawaan (n \u003d 29), penyakit menular - pneumonia, sepsis, meningoensefalitis bakterial (n \u003d 37), kerusakan SSP perinatal (n \u003d 11), sindrom kematian mendadak (n \u003d 6) dan penyakit lainnya ( n \u003d 3). Kelompok kontrol terdiri dari 438 bayi baru lahir yang secara klinis sehat (227 perempuan, 211 laki-laki) pada usia 3-8 hari. Dalam kelompok ini, nilai referensi konsentrasi asam amino dan asilkarnitin dalam darah kapiler ditentukan pada anak sehat pada periode neonatal.

Materi penelitian adalah arsip sampel darah tepi pada kertas formulir tes standar, diperoleh pada umur 3-8 hari untuk skrining neonatal standar. Konsentrasi asam amino dan asilkarnitin (Tabel 1) dalam darah ditentukan dengan spektrometri massa tandem (MS / MS) menggunakan spektrometer massa tandem quadrupole Agilent 6410 (Agilent Technologies, USA) menurut metode bersertifikat dari perusahaan CHROMSYSTEM No. V1 07 05 57136 001. dilakukan di laboratorium genetika medis Institut Medis Negeri Rostov di Kementerian Kesehatan Rusia.

Tabel 1

Metabolit ditentukan oleh MS / MS

	Metabolit	Simbol	Metabolit	Simbol
*A m in o k dan slot*
			3-methylcrotonylcarntine
	Asam aspartat		3-hydroxyisovalerylcarnitine
	Asam glutamat		Hexanoylcarnitine
	Leusin + Isoleusin		Octanoylcarnitine
	Metionin		Octenoylcarnitine
	Fenilalanin		Decanoylcarnitine
			Decenoylcarnitine
			Dodecanoylcarnitine
			Myristilcarnitine
	Sitrulin		Tetradecenoylcarnitine
			Tetradecinoylcarnitine
			Hydroxymyristylcarntine
*A ts dan lkar n dan t in s*			Palmitoylcarnitine
	Karnitin gratis		Hexadecenoylcarnitine
	Asetilkarnitin		Hydroxyhexadecenoylcarnitine
	Propionylcarnitine		Hydroxypalmitoylcarnitine
	Malonylcarnitine		Stearoylcarnitine
	Butyrylcartin		Oleoylcarnitine
	Methylmalonylcarnitine		Hydroxystearoylcarnitine
	Izovalerylcartin		Hydroxyoleoylcarnitine
	Glutarylcarnitine		Hydroxylinoylcarnitine

Pengolahan data statistik yang diperoleh dilakukan dengan menggunakan paket aplikasi Statistica 6.0 dan spreadsheet Excel 2007. Untuk mengetahui karakteristik numerik deskriptif variabel digunakan metode analisis statistik standar: menghitung median, persentil 0,5 dan 99,5.

Untuk konfirmasi diagnosis genetik molekuler leucinosis, DNA diisolasi dari bercak darah kering menggunakan kit reagen DiatomDNAPrep (Biocom LLC, Rusia). Pemilihan primer untuk amplifikasi PCR dilakukan untuk 10 ekson gen BCKDHA dan BCKDHB. Pengurutan fragmen PCR untuk mendeteksi mutasi langka dilakukan sesuai dengan protokol pabrik pada penganalisis genetika ABIPrism 3500 (Applied Biosystem, USA).

Hasil penelitian dan pembahasannya

Sebagai hasil dari studi konsentrasi asam amino dan asilkarnitin dalam darah tepi dari 438 bayi baru lahir yang secara klinis sehat, konsentrasi 0,5 dan 99,5 dari metabolit yang diteliti ditentukan, yang digunakan oleh kami di masa depan sebagai nilai referensi (Tabel 2). Perbandingan konsentrasi asam amino dan asilkarnitin, ditentukan dalam sampel darah 86 anak yang meninggal pada tahun pertama kehidupan, dengan nilai konsentrasi referensi, menunjukkan bahwa pada 82 pasien (95,3%) tidak ada parameter yang diteliti melebihi 0,5 dan 99, 5 persentil dari kelompok kontrol, yang memungkinkan untuk meninggalkan versi kerja tentang adanya gangguan metabolisme asam amino dan karnitin, yang tidak diverifikasi secara in vivo. Namun, pada 4 anak (4,7%), konsentrasi beberapa asam amino dan asilkarnitin beberapa kali lebih tinggi dari batas atas interval referensi kelompok kontrol (Tabel 2).

Meja 2

Hasil penilaian retrospektif konsentrasi asam amino dan asilkarnitin pada bayi baru lahir (n \u003d 4) dengan kadar metabolit individu di luar kisaran persentil 0,5-99,5

	Metabolisme	Konsentrasi metabolit individu (μmol / L)
		Nilai referensi dari kelompok kontrol (n \u003d 438) dalam jangkauan 0,5-99,5 persentil	Nilai individu pasien (n \u003d 4) *
			Pasien 1	Pasien 2	Pasien 3	Pasien 4
*A m in o k dan slot*



			2503,868






						1457,474

*A ts dan lkar n dan t in s*

* Catatan:

Pasien 1 - laki-laki KM (diagnosis: bronkiolitis obstruktif), meninggal pada usia 11 bulan;

Pasien 2 - laki-laki CF (diagnosa: pneumonia), meninggal pada usia 1 bulan;

Pasien 3 - PV wanita (diagnosis: sepsis), meninggal pada usia 12 hari.

Pasien 4 - gadis PA (diagnosa: pneumonia), meninggal pada usia 6 hari.

Dalam kasus pertama, pada pasien CM yang meninggal pada usia 11 bulan dengan diagnosis bronkiolitis obstruktif, spektrometri massa tandem asam amino dan asilkarnitin dalam sampel darah yang diarsipkan mengungkapkan perubahan dalam kandungan leusin, isoleusin dan valin, yang sifatnya cukup spesifik untuk berbicara tentang kemungkinan tinggi bawaan cacat metabolik di jalur katabolisme leusin dan isoleusin. Dalam sampel darah arsip dipelajari, peningkatan konsentrasi leusin dan isoleusin lebih dari 9 kali dan valin lebih dari 3 kali dibandingkan dengan nilai referensi ditemukan, yang menunjukkan diagnosis penyakit dengan bau urin sirup maple.

Dari data klinis yang tersedia yang mendukung leukinosis pada anak BM, manifestasi klinis berikut dibuktikan: penolakan awal menyusui, gejala ensefalopati neonatal, peningkatan gejala neurologis - perubahan tonus otot, kejang, epilepsi, perkembangan psikomotor yang tertunda. Anak tersebut sering mengalami infeksi saluran pernafasan yang parah, yang menyebabkan bronkiolitis yang melenyapkan, yang menjadi penyebab kematian pada usia 11 bulan. Kami tidak memiliki informasi tentang apakah anak tersebut memiliki bau urin tertentu, tetapi peningkatan konsentrasi metabolit yang khas untuk leucinosis dan gejala klinis yang khas mengkonfirmasi asumsi kami. Selain itu, diagnosis penyakit bau urine sirup maple didukung oleh hasil diagnosis DNA leukinosis menggunakan arsip sampel darah. Analisis genetik molekuler mengungkapkan pada anak penghapusan c.98delG pada ekson pertama gen BCKDHB dalam keadaan heterozigot. Mutasi yang sama ditemukan dalam darah ibu. Karena terbatasnya jumlah sampel darah yang diarsipkan dari anak tersebut dan tidak dapat diaksesnya materi biologis dari ayahnya, mutasi kedua tidak dapat dideteksi. Namun, kombinasi data klinis, biokimia dan genetik molekuler mendukung diagnosis leucinosis (atau penyakit berbau urine sirup maple, MIM ID 248600) dalam kasus yang diteliti.

Dalam tiga kasus lainnya, perubahan yang terungkap dalam profil asam amino dan asilkarnitin tidak memiliki karakter spesifik yang sama seperti pada kasus sebelumnya. Tidak mungkin untuk mengasumsikan NBO tertentu berdasarkan data MS / MS, dan terlebih lagi untuk menegaskan dengan pasti, dalam kasus ini. Untuk diagnosis banding aminoasidopati dan acidurias organik, tes darah berulang dengan metode MS / MS, studi klinis dan biokimia tambahan akan diperlukan.

Peningkatan metabolit spesifik penyakit bervariasi dan bergantung pada banyak faktor. Diet anak dan obat-obatan tertentu harus dipertimbangkan saat menafsirkan hasil. Jadi, mengonsumsi obat yang mengandung asam valproat atau trigliserida rantai menengah menyebabkan peningkatan C6, C8 dan C10, yang mempersulit diagnosis defisiensi asil-CoAdehydrogenase rantai menengah. Mengonsumsi obat yang mengandung karnitin juga dapat meningkatkan konsentrasi asilkarnitin rantai pendek dan menengah. Kandungan asilkarnitin rantai panjang dalam plasma dan darah lengkap berbeda, karena mereka terkait dengan membran eritrosit, oleh karena itu, indeks hematokrit memiliki nilai tertentu. Dengan beberapa pengecualian, peningkatan konsentrasi satu setengah hingga dua kali lipat membutuhkan tes darah kedua. Dengan demikian, tingkat metabolit patognomonik untuk propionik dan isovalerian aciduria biasanya meningkat lebih dari 5 kali lipat, dan bahkan sedikit perubahan dalam konsentrasi glutarylcarnitine tidak hanya memerlukan tes darah berulang, tetapi juga studi tambahan tentang karakteristik asam urin organik tipe I glutaric aciduria.

Kesimpulan

Sebuah studi retrospektif sampel darah dari anak-anak yang meninggal karena berbagai sebab, yang dilakukan dengan metode MS / MS, menunjukkan pada sejumlah kasus patologi metabolik herediter. Salah satunya, diagnosis penyakit dipastikan dengan bau urine sirup maple (leucinosis). Tindakan diagnostik yang tepat waktu dalam kasus seperti itu merupakan komponen penting dalam diagnosis banding dari kesalahan metabolik kongenital. Studi tentang konsentrasi asam amino dan asilkarnitin dalam sampel cairan biologis dapat menjadi nilai diagnostik dalam analisis kasus kematian bayi. Diagnosis anumerta penyakit metabolik herediter pada anak yang meninggal merupakan indikasi untuk konseling genetik medis keluarga. Metode MS / MS dalam skrining neonatal perlu diperkenalkan secara luas sebagai alat utama untuk mendeteksi aminoasidopati, asidemia organik dan defek oksidasi asam lemak β-mitokondria pada bayi baru lahir untuk diagnosis dan pengobatan NBO yang tepat waktu.

Peninjau:

Polevichenko Elena Vladimirovna, Dr. med. Sci., Profesor, Kepala Peneliti dari Departemen Rehabilitasi dan Bantuan Medis dan Sosial dari Lembaga Anggaran Negara Federal "Pusat Penelitian Federal untuk Hematologi, Onkologi dan Imunologi Pediatrik dinamai Dmitry Rogachev" dari Kementerian Kesehatan Rusia, Moskow.

Mikhailova Svetlana Vitalievna, Dr. med. Sci., Kepala Departemen Genetika Medis, Rumah Sakit Klinis Anak Rusia di Kementerian Kesehatan Rusia, Moskow.

Referensi bibliografi

Baydakova G.V., Antonets A.V., Golikhina T.A., Matulevich S.A., Amelina S.S., Kutsev S.I., Kutsev S.I. DIAGNOSTIK RETROSPEKTIF PENYAKIT TUKAR BERDARAH DENGAN METODE SPEKTROMETRI MASSA TANDEM // Masalah modern sains dan pendidikan. - 2013. - No. 2 .;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id\u003d8953 (tanggal akses: 12.12.2019). Kami meminta perhatian Anda pada jurnal yang diterbitkan oleh "Academy of Natural Sciences"

Menurut review yang diterbitkan dalam Clinical Biochemist Reviews, penggunaan kromatografi cair kinerja tinggi yang dikombinasikan dengan spektrometri massa tandem (HPLC-MS / MS) di laboratorium klinis telah berkembang pesat selama 10-12 tahun terakhir. Para penulis mencatat bahwa spesifisitas analisis HPLC-MS / MS secara signifikan lebih unggul daripada metode imunologi dan kromatografi cair kinerja tinggi klasik (HPLC) dalam analisis molekul dengan berat molekul rendah dan memiliki kinerja yang jauh lebih tinggi daripada spektrometri massa kromatografi gas (GC-MS). Popularitas metode ini dalam analisis klinis rutin saat ini dijelaskan oleh kemampuan unik metode tersebut.

Analisis kuantitatif yang akurat dari molekul kecil;
Analisis simultan dari beberapa senyawa target;
Kekhususan unik;
Analisis kecepatan tinggi.

Dalam beberapa tahun terakhir, banyak perhatian diberikan pada waktu analisis dan, sebagai hasilnya, pada peningkatan produktivitas laboratorium. Penurunan waktu analisis yang signifikan dimungkinkan dengan penggunaan kolom analitik pendek untuk HPLC / MS / MS, sekaligus secara dramatis meningkatkan spesifisitas analisis. Penggunaan ionisasi tekanan atmosfer (API), spektrometer massa tiga kuadrupol tandem dan kromatografi cair kinerja tinggi yang canggih, serta metode persiapan sampel terkait, telah menempatkan HPLC-MS / MS di garis depan metode analitik modern untuk penelitian klinis.

Memperoleh profil lengkap metabolisme steroid (panel steroid), purin dan pirimidin dan senyawa lainnya,
skrining bayi baru lahir untuk kesalahan metabolisme bawaan (deteksi beberapa lusin penyakit dalam satu analisis);
Pemantauan terapeutik untuk produk obat - imunosupresan, periokonvulsan, antiretroviral, antikoagulan, dan lainnya - terlepas dari ketersediaan kit pabrikan. Tidak perlu membeli kit mahal untuk setiap zat - Anda dapat mengembangkan metode Anda sendiri;
Toksikologi klinis - analisis lebih dari 500 senyawa narkotika dan metabolitnya dalam satu analisis, tanpa analisis konfirmasi
proteomik dan metabolomik.

Selain itu, HPLC-MSMS digunakan untuk menyaring oligosakarida urin, sulfatida, asam lemak rantai panjang, asam empedu rantai panjang, asam metilmalonat, studi porfiria, dan skrining pasien dengan gangguan metabolisme purin dan pirimidin.

Contoh terapan untuk kromatografi cair
dikombinasikan dengan spektrometri massa tandem dalam analisis klinis.

Skrining bayi baru lahir: Contoh pertama penggunaan massal HPLC-MS / MS dalam diagnosis klinis adalah skrining kesalahan metabolisme bawaan pada bayi baru lahir. Saat ini, di negara maju, ini adalah metode rutin dan mencakup lebih dari 30 penyakit berbeda, termasuk acedemia, aminoacidopathy, dan defek oksidasi asam lemak. Catatan khusus adalah penelitian tentang cacat lahir, yang dapat menyebabkan masalah serius kecuali jika tindakan segera diambil (seperti pembesaran jantung atau hati atau edema serebral). Keuntungan menggunakan HPLC-MS / MS untuk skrining bayi baru lahir adalah kemampuan untuk menganalisis semua asam amino dan asilkarnitin secara bersamaan dengan metode yang cepat, murah, dan sangat spesifik.

Pemantauan obat terapeutik: Pengembangan dan pengenalan sirolimus imunosupresan (rapamycin) untuk pencegahan penolakan organ setelah transplantasi telah menjadi salah satu insentif utama untuk pengenalan HPLC-MS / MS ke laboratorium klinis. Metode HPLC-MS / MS modern memungkinkan penentuan tacrolimus, sirolimus, siklosporin, everolimus, dan asam mikofenat secara bersamaan.

HPLC-MS / MS juga digunakan untuk analisis sitotoksik, obat antiretroviral, antidepresan trisiklik, antikonvulsan dan obat lain yang memerlukan dosis individual.

Metode HPLC-MSMS memungkinkan untuk memisahkan dan mengukur R- dan S-enansiomer warfarin dalam kisaran konsentrasi 0,1-500 ng / ml.

Narkotika dan pereda nyeri: HPLC-MS / MS banyak digunakan untuk analisis senyawa ini karena kesederhanaan persiapan sampel dan waktu analisis yang singkat. Metode tersebut saat ini digunakan di laboratorium klinis untuk skrining keberadaan berbagai macam obat. Kekhususan dan kepekaan yang unik dari metode ini memungkinkan untuk secara bersamaan menganalisis lebih dari 500 senyawa dari berbagai kelas dalam satu sampel dengan persiapan sampel yang minimal. Jadi, dalam kasus analisis urin, pengenceran sederhana sampel sebanyak 50-100 kali sudah cukup. Saat menganalisis rambut, alih-alih sekumpulan 100-200 rambut, satu helai rambut sudah cukup untuk mengidentifikasi fakta penggunaan narkoba secara andal.

Analisis Endokrinologi dan Steroid: HPLC-MS / MS banyak digunakan di banyak laboratorium endokrinologi untuk analisis steroid - testosteron, kortisol, aldesteron, progesteron, estriol dan banyak lainnya.

Semakin banyak laboratorium mulai menggunakan HPLC-MS / MS untuk menentukan kadar vitamin D3 dan D2 dalam darah.

I. Definisi steroid (profil steroid).

Laboratorium rumah sakit dan klinik sekarang memiliki kemampuan untuk melakukan HPLC / MS / MS penentuan beberapa steroid secara bersamaan. Pada saat yang sama, tidak diperlukan volume sampel yang besar, yang terutama penting saat menganalisis sampel anak-anak.

Hiperplasia adrenal kongenital (CAH) adalah kelainan bawaan pada biosintesis steroid. Ini adalah kelompok penyakit keturunan yang disebabkan oleh aktivitas enzim korteks adrenal yang tidak tepat, yang menyebabkan penurunan produksi kortisol. Untuk diagnosis SAN yang andal, disarankan untuk menentukan kortisol, androstenedion, dan 17-hidroksiprogesteron. HPLC / MS / MS memungkinkan penghitungan yang akurat dari ketiga steroid sekaligus dengan keyakinan 100%.
Skrining rutin bayi baru lahir menggunakan immunoassay ditandai dengan tingginya tingkat hasil lonopositif dan negatif palsu. Penentuan HPLC / MS / MS tidak hanya kortisol, tetapi juga aldosteron dan 11-deoxycortisol, memungkinkan untuk membedakan insufisiensi korteks adrenal primer dan sekunder.
HPLC / MS / MS memungkinkan penentuan steroid pada prostatitis dan sindrom nyeri panggul kronis.
HPLC-MS / MS menyediakan profil steroid dan identifikasi penyebab pubertas prekoks terkait adrenal pada anak kecil. Ditemukan bahwa konsentrasi testosteron, androstenedion, dehydroepiandrosterone (DHEA) dan sulfatnya pada anak-anak ini sedikit lebih tinggi dibandingkan pada anak-anak yang lebih tua pada kelompok kontrol.
Serum perokok aktif, perokok pasif dan non-perokok dianalisis keberadaan 15 hormon steroid dan hormon tiroid untuk mengetahui hubungan antara pasien yang terpapar asap dan konsentrasi hormon.
HPLC / MS / MS digunakan dalam pembuatan profil hormon steroid wanita tertentu dalam urin.
Dengan menggunakan HPLC / MS / MS, konsentrasi hormon neuroaktif dievaluasi untuk mencegah neuropati diabetik.

II. Penentuan hormon tiroid

Metode rutin untuk menentukan hormon tiroid biasanya didasarkan pada radioimmunoassay, yang mahal harganya dan hanya mendeteksi T3 dan T4, yang dapat membatasi kemampuan untuk menentukan dan mengatur fungsi tiroid sepenuhnya.

Saat ini, saat menggunakan HPLC-MSMS, lima hormon tiroid dianalisis secara bersamaan dalam sampel serum darah, termasuk tiroksin (T4), 3,3 ′, 5-triiodothyronine (T3), 3,3 ′, 5′- (rT3), 3 , 3'-diiodothyronine (3,3'-T2) dan 3,5-diiodothyronine (3,5-T2) pada kisaran konsentrasi 1-500 ng / ml.
Metode HPLC / MS / MS juga digunakan untuk menganalisis komposisi hormon pasien yang menjalani tiroidektomi. Tingkat konsentrasi tiroksin (T4), triiodothyronine (T3), T4 bebas dan hormon perangsang tiroid (TSH) setelah operasi ditentukan. Telah ditemukan bahwa HPLC / MS / MS adalah cara terbaik untuk membangun hubungan antara TSH dan konsentrasi hormon tiroid.
Metode HPLC / MS / MS digunakan untuk menentukan tiroksin (T4) dalam saliva dan serum manusia. Metode ini dicirikan oleh reproduktifitas tinggi, akurasi, dan batas deteksi 25 pkg / ml. Penelitian telah menunjukkan bahwa ada hubungan diagnostik dalam konsentrasi T4 saliva antara subjek eutiroid dan pasien dengan penyakit Graves.

Metode HPLC / MS / MS sekarang memiliki sensitivitas, spesifisitas dan akurasi yang diperlukan untuk penentuan yang andal dari semua steroid dalam cairan biologis dan dengan demikian meningkatkan kemampuan diagnostik, terutama dalam kasus kit steroid.

AKU AKU AKU. Penentuan 25-oxyvitamin D oleh HPLC / MS / MS

25-hidroksi vitamin D (25OD) adalah bentuk sirkulasi utama dari vitamin D dan prekursor bentuk aktifnya. (1,25-dioxyvitamin D). Karena waktu paruhnya yang lama, penentuan 25OD penting untuk menentukan status vitamin D dalam tubuh pasien. Vitamin D ada dalam dua bentuk: vitamin D3 (cholecalciferol) dan vitamin D2 (ergocalciferol). Kedua bentuk tersebut dimetabolisme menjadi bentuk 25OD yang sesuai. Yang sangat penting untuk diagnosa adalah tersedianya metode analitik yang dapat menentukan dengan akurasi tinggi kedua bentuk vitamin dan memungkinkan pemantauan pasien dengan gangguan vitamin D. Metode yang digunakan selama ini tidak memungkinkan untuk penentuan vitamin D2 dan D3 secara terpisah. Selain itu, pada konsentrasi vitamin D2 yang tinggi, jumlah D3 yang terdeteksi diremehkan. Kerugian lainnya adalah penggunaan isotop radioaktif. Penggunaan metode HPLC / MS / MS memungkinkan tidak hanya untuk menghindari penggunaan isotop radioaktif, tetapi juga untuk melakukan penentuan terpisah dari kedua bentuk aktif vitamin.

Jika Anda mencurigai rendahnya kandungan vitamin D dalam tubuh;
Jika Anda mencurigai adanya efek toksik yang tidak dapat dijelaskan;
Saat memeriksa pasien yang menjalani pengobatan untuk kandungan vitamin D yang rendah;
Penggunaan HPLC / MS / MS memungkinkan penentuan kedua bentuk secara terpisah dalam pemantauan pasien.

IV. Penentuan imunosupresan dengan HPLC / MS / MS

Setelah transplantasi organ, Anda harus mengonsumsi imunosupresan sepanjang hidup Anda untuk menghindari penolakan. Dengan kisaran terapeutik yang sangat sempit dan toksisitas yang tinggi, imunosupresan memerlukan dosis individual untuk memaksimalkan efeknya. Oleh karena itu, penting untuk memantau imunosupresan utama: siklosporin A, tacrolimus, sirolimus dan everolimus untuk menyesuaikan dosis obat untuk setiap pasien tergantung pada konsentrasi obat di dalam darah.

Immunoassay masih digunakan untuk memantau obat yang terdaftar, tetapi metode ini mahal dan spesifisitas, keakuratan, dan reproduksinya terbatas. Ada kasus kematian pasien yang diketahui akibat dosis imunosupresan yang salah, berdasarkan hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode imunologi. Saat ini, immunoassay sedang diganti di laboratorium klinis oleh HPLC / MS / MS. Jadi, di klinik Universitas Munich, sekitar 70 sampel dianalisis setiap hari untuk mengetahui kandungan sirolimus dan siklosporin A menggunakan sistem HPLC / MS / MS. Semua persiapan sampel dan kontrol instrumen dilakukan oleh satu orang. Laboratorium juga beralih ke analisis tacrolimus dengan metode ini.

Penggunaan HPLC / MS / MS untuk penentuan rutin simultan tacrolimus, sirolimus, ascomycin, demethixisirolimus, cyclosporin A dan cyclosporin G dalam darah dijelaskan. Kisaran yang ditentukan oleh konsentrasinya adalah 1,0 - 80,0 ng / ml. Untuk siklosporin 25 - 2000 ng / ml. Lebih dari 50.000 sampel dianalisis di laboratorium sepanjang tahun.
Karena ditemukan bahwa penggunaan tacrolimus dan sirolimus secara simultan memberikan efek terapeutik yang positif, metode HPLC / MS / MS yang sederhana dan efektif dikembangkan untuk penentuan terpisah dalam darah untuk analisis klinis. Analisis satu sampel membutuhkan waktu 2,5 menit dengan akurasi 2,46% - 7,04% untuk tacrolimus dan 5,22% - 8,30% untuk sirolimus untuk keseluruhan kurva analitik. Batas bawah deteksi tacrolimus adalah 0,52 ng / ml, untuk sirolimus - 0,47 ng / ml.

V. Penentuan homosistein oleh HPLC / MS / MS

Homosistein tertarik pada penyakit kardiovaskular (tromboemboli, penyakit jantung, aterosklerosis) dan kondisi klinis lainnya (depresi, penyakit Alzheimer, osteoporosis, komplikasi selama kehamilan, dll.). Metode yang ada untuk analisis homosistein, termasuk immunoassay, mahal. Metode HPLC / MS / MS yang cepat untuk analisis homosistein telah dikembangkan untuk penggunaan klinis rutin saat menganalisis sejumlah besar sampel. Ionisasi dilakukan dengan metode electrospray. Metode ini dapat direproduksi, sangat spesifik dan akurat. Keuntungan dari metode ini adalah biaya reagen yang rendah dan kesederhanaan persiapan sampel. Dimungkinkan untuk menganalisis 500 atau lebih sampel per hari.

Kesimpulan

Perlu dicatat bahwa meskipun metode immunoassay yang ditingkatkan secara signifikan saat ini digunakan, karena keterbatasan teknis yang mendasar, metode ini tidak akan pernah memiliki akurasi dan spesifisitas untuk zat target yang sebanding dengan HPLC-MSMS, terutama dengan adanya metabolit. Hal ini tidak hanya menyebabkan akurasi yang rendah dari metode ELISA dan persentase hasil positif palsu dan negatif palsu yang tinggi, tetapi juga tidak memungkinkan untuk membandingkan hasil yang diperoleh di departemen klinis yang berbeda menggunakan metode ELISA. Penggunaan HPLC-MS / MS menghilangkan kerugian ini, memungkinkan analisis yang sangat spesifik, akurat dan cepat dari sejumlah besar sampel dengan keandalan yang tinggi dengan adanya metabolit dan tidak adanya gangguan dari zat bersamaan dan endogen dalam plasma dan darah pasien.

Terlepas dari biaya kompleks instrumen yang tampaknya tinggi, seperti yang diperlihatkan oleh praktik dunia, dengan pengoperasian yang tepat, kompleks ini terbayar dalam 1-2 tahun. Hal ini terutama disebabkan oleh biaya rendah per analisis karena analisis simultan dari puluhan dan ratusan senyawa dan tidak adanya kebutuhan untuk membeli peralatan diagnostik yang mahal. Selain itu, laboratorium memiliki kesempatan untuk secara mandiri mengembangkan metode analisis apa pun yang diperlukan dan tidak bergantung pada produsen kit.

Memilih konfigurasi yang benar dari kompleks instrumen

Ada sejumlah besar metode spektrometri massa dan jenis spektrometer massa yang dirancang untuk memecahkan berbagai masalah - mulai dari identifikasi struktural makromolekul protein kompleks yang beratnya ratusan ribu Dalton hingga analisis kuantitatif throughput tinggi rutin dari molekul kecil.

Untuk penyelesaian tugas yang berhasil, salah satu syarat utamanya adalah pilihan jenis peralatan yang tepat. Tidak ada instrumen satu ukuran untuk semua untuk menyelesaikan seluruh spektrum tugas analitis. Dengan demikian, perangkat yang dirancang untuk memecahkan masalah identifikasi mikroorganisme tidak mampu menganalisis molekul kecil secara kuantitatif. Dan sebaliknya. Faktanya adalah, meskipun namanya umum, ini adalah perangkat yang sama sekali berbeda yang beroperasi pada prinsip fisik yang berbeda. Dalam kasus pertama, ini adalah spektrometer massa waktu terbang dengan sumber ionisasi laser - MALDI-TOF, dan yang kedua - tiga kuadrupol dengan ionisasi elektrospray - HPLC-MSMS.

Parameter terpenting kedua adalah memilih konfigurasi sistem yang benar. Ada beberapa produsen utama peralatan spektrometri massa. Setiap perangkat pabrikan tidak hanya memiliki kekuatannya sendiri, tetapi juga kelemahan, yang biasanya mereka lebih suka diam. Setiap pabrikan memproduksi lini perangkatnya sendiri. Biaya satu kompleks analitik berkisar dari $ 100.000 hingga $ 1.000.000 atau lebih. Pilihan pabrikan yang optimal dan konfigurasi peralatan yang benar tidak hanya akan menghemat sumber daya keuangan yang signifikan, tetapi juga memecahkan masalah dengan lebih efektif. Sayangnya, banyak contoh peralatan laboratorium dibuat tanpa memperhitungkan faktor-faktor tersebut. Hasilnya adalah peralatan menganggur, uang terbuang percuma.

Faktor ketiga dalam keberhasilan sebuah laboratorium adalah personel. Spektrometer massa membutuhkan personel yang berkualifikasi tinggi. Sayangnya, tidak ada satu pun universitas Rusia yang memiliki kursus tentang spektrometri massa praktis modern, terutama yang berkaitan dengan aplikasi klinis, dan tugas melatih personel di setiap laboratorium harus diselesaikan sendiri. Secara alami, 2-3 hari pelatihan pengenalan yang dilakukan oleh pabrikan setelah dimulainya peralatan sama sekali tidak cukup untuk memahami dasar-dasar metode dan memperoleh keterampilan untuk bekerja dengan perangkat.

Faktor keempat adalah kurangnya metode analisis yang siap pakai. Setiap laboratorium mempunyai tugas prioritasnya masing-masing, untuk pemecahannya perlu dikembangkan metodenya sendiri. Ini dapat dilakukan oleh orang yang memiliki setidaknya 2-3 tahun pengalaman dengan perangkat tersebut. Pabrik terkadang menyediakan satu atau dua pedoman umum yang bersifat rekomendatif, tetapi tidak menyesuaikannya untuk tugas laboratorium tertentu.

DI LLC "BioPharmExpert" spesialis dengan pengalaman bertahun-tahun bekerja pada berbagai jenis spektrometer massa, serta pengembangan metode dan perumusan analisis kinerja tinggi. Oleh karena itu, kami menyediakan layanan berikut:

Pemilihan konfigurasi perangkat yang optimal untuk tugas klien tertentu.
Pembelian, suplai, dan peluncuran peralatan dari produsen terkemuka spektrometer massa tandem. Pelatihan personel langkah demi langkah dalam waktu satu tahun sejak tanggal peluncuran peralatan.
Seperangkat metode dan database siap pakai untuk memecahkan masalah klinis dasar.
Pengembangan metode analisis dan solusi masalah spesifik klien di laboratoriumnya dengan melibatkan stafnya.
Dukungan metodologis di semua tahap pekerjaan.

Selama bertahun-tahun, sebagian besar penyaringan telah dilakukan tesspesifik untuk setiap penyakit individu. Misalnya, skrining PKU didasarkan pada penilaian mikrobiologis atau kimiawi dari peningkatan fenilalanin.

Situasi ini telah berubah total pada akhirnya dasawarsa dengan munculnya teknologi tandem mass spectrometry (TMS). Analisis spektrometri massa tandem (TMS) tidak hanya dapat secara akurat dan cepat mendeteksi peningkatan fenilalanin dalam bercak darah pada bayi baru lahir dengan hasil positif palsu yang lebih sedikit dibandingkan dengan metode yang lebih lama, tetapi juga secara bersamaan mendeteksi beberapa lusin kelainan biokimia lainnya.

Beberapa dari mereka telah disaring tes individu... Sebagai contoh, banyak negara bagian telah menggunakan tes khusus untuk mendeteksi peningkatan metionin untuk mendeteksi spektrometri massa tandem (TMS) juga telah terbukti menjadi metode yang dapat diandalkan untuk skrining non-natal untuk beberapa penyakit yang memenuhi kriteria skrining tetapi tidak memiliki tes yang sebelumnya dapat diandalkan.

Sebagai contoh, ketidakcukupan MCAD - penyakit oksidasi asam lemak, biasanya asimtomatik, tetapi dapat dideteksi secara klinis bila pasien mengalami peningkatan katabolisme. Deteksi defisiensi MCAD saat lahir sangat penting karena anak-anak yang sakit memiliki risiko hipoglikemia yang sangat tinggi yang mengancam jiwa pada anak usia dini dalam kondisi katabolik yang disebabkan oleh penyakit yang menyertai seperti infeksi virus.

Hampir seperempat anak dengan defisiensi MCAD yang tidak terdiagnosis mati di episode pertama. Dengan pengobatan yang tepat, gangguan metabolisme bisa dibalik. Jika MCAD tidak mencukupi, tujuan utama skrining adalah untuk mengingatkan orang tua dan dokter tentang risiko dekompensasi metabolik, karena anak-anak secara praktis sehat di antara serangan dan tidak memerlukan perawatan harian, kecuali untuk mengecualikan puasa berkepanjangan.

Masih digunakan spektrometri massa tandem (TMS) untuk skrining neonatal masih dipertanyakan. Selain memberikan pengujian cepat dari banyak kelainan yang skrining neonatal sudah dilakukan atau mungkin diperlukan, spektrometri massa tandem (TMS) juga mendeteksi bayi baru lahir dengan kesalahan metabolisme bawaan seperti asidemia metilmalonat, yang biasanya tidak disertakan dalam program skrining karena kelangkaan dan kesulitannya dalam memberikan terapi definitif yang melindungi dari kerusakan neurologis progresif.

Penyakit yang Terdeteksi dengan Spektrometri Massa Tandem

SAYA. Aminoasidemia:
- PKU
- Penyakit kencing dengan bau sirup maple
- Homocystinuria
- Sitrulinemia
- Arginine amber aciduria
- Tirosinemia tipe I

II. Asidemia organik:
- Asidemia propionik
- Asidemia metilmalonat
- Asidemia Isovalerian
- Terisolasi 3-methyl-crotonyl-glycinemia
- Asidemia glutarat (tipe I)
- Defisiensi asetoasetil-koA-tiolase mitokondria
- Asidemia hidroksimetilglutarat
- Kurangnya banyak karboksilase coA

AKU AKU AKU. Gangguan oksidasi asam lemak:
- SCAD tidak mencukupi
- Kekurangan hidroksi-SCAD
- Kekurangan MCAD
- VLCAD tidak mencukupi
- Defisiensi LCAD dan defisiensi protein trifungsional
- Asidemia glutarat tipe II
- Kekurangan karnitin palmitoyltransferase II

Spektrometri massa tandem (TMS) juga dapat mengidentifikasi metabolit abnormal dengan signifikansi kesehatan yang tidak dapat ditentukan. Misalnya, defisiensi SCAD adalah gangguan oksidasi asam lemak lain yang paling sering asimtomatik, meskipun beberapa pasien mungkin mengalami kesulitan dengan hipoglikemia episodik. Dengan demikian, nilai prediksi uji spektrometri massa tandem positif (TMS) untuk SCAD simptomatik kemungkinan besar sangat rendah.

Apakah keuntungan dari deteksi lebih besar daripada kekurangan SCAD efek negatif dari tes yang menyebabkan perhatian orang tua yang tidak semestinya pada sebagian besar bayi baru lahir yang hasil tesnya positif dan tidak pernah menunjukkan gejala klinis? Dengan demikian, tidak setiap penyakit yang terdeteksi oleh spektrometri massa tandem (TMS) memenuhi kriteria untuk skrining neonatal.

Inilah mengapa beberapa ahli sistem perawatan kesehatan berpendapat bahwa orang tua dan dokter hanya boleh diberi tahu tentang kelainan pada metabolit dengan manfaat klinis yang telah terbukti. Yang lain menganjurkan penggunaan semua informasi yang disediakan oleh spektrometri massa tandem (TMS) dan menyarankan bahwa orang tua dan dokter harus diberi tahu tentang semua metabolit abnormal, tidak peduli seberapa baik penyakit tersebut memenuhi kriteria standar untuk skrining neonatal. Pasien dengan anomali yang tidak diketahui signifikansinya kemudian dapat dimonitor secara ketat. Untuk semua alasan ini, penggunaan spektrometri massa tandem (TMS) dalam skrining bayi baru lahir tetap menjadi bahan perdebatan.

Untuk skrining populasi Pada periode prenatal, dua tes biasanya digunakan: analisis kromosom pada wanita yang lebih tua dan AFP serum ibu atau NTD tiga kali lipat dan aneuploidi kromosom.

Jika kehamilan berisiko karena prosedur invasif untuk diagnosis prenatal aneuploidi kromosom karena usia ibu, pengujian tambahan juga harus ditawarkan, misalnya, penentuan kadar AFP dalam cairan ketuban, hibridisasi komparatif seluruh genom untuk mencari penghapusan submikroskopis yang berbahaya, skrining untuk mutasi fibrosis kistik dan penyakit umum lainnya.

Apa itu Spektrometri Massa Tandem

Spektrometri massa tandem (TMS) adalah salah satu metode modern untuk analisis senyawa, yang banyak digunakan untuk berbagai keperluan ilmiah dan praktis. Metode ini memungkinkan analisis beberapa ratus senyawa dalam jumlah mikro bahan biologis.

Dimana metode ini diterapkan?

Dalam praktek pelayanan kesehatan dunia, metode ini digunakan untuk melakukan skrining massal pada bayi baru lahir untuk penyakit metabolik herediter (NBD). Di tempat darah kering, dimungkinkan untuk menentukan asam amino (termasuk fenilalanin) dan asilkarnitin. Penentuan kuantitatif zat ini memungkinkan untuk mengecualikan beberapa lusin penyakit keturunan yang termasuk dalam kelas NBO yang berbeda (gangguan metabolisme asam amino, asam organik dan cacat pada oksidasi β mitokondria asam lemak). Menurut data literatur asing, frekuensi total mereka adalah 1: 2000 bayi baru lahir hidup. Sebelumnya, diagnosis kelainan ini membutuhkan bahan biologis dalam jumlah besar, beberapa penelitian (analisis asam amino, spektrometri kromatomassa, penentuan spektrum asilkarnitin), yang membutuhkan waktu dan biaya bahan yang signifikan. TMS memungkinkan Anda untuk mengukur semua senyawa ini dalam satu analisis!

Penyakit apa yang dapat dideteksi dengan metode ini?

Sayangnya, satu tes universal, sangat sensitif dan spesifik untuk diagnosis semua NBO yang diketahui belum ada, tetapi teknologi yang ditujukan untuk mendeteksi beberapa lusin atau bahkan ratusan penyakit dalam satu analisis sudah menjadi kenyataan. TMS juga termasuk dalam metode tersebut. Metode ini memungkinkan untuk mengidentifikasi dengan keandalan tinggi sekitar 40 kelainan turunan dari metabolisme asam amino, asam organik, dan cacat pada oksidasi beta mitokondria asam lemak. Sebagian besar penyakit ini terjadi selama periode neonatal. Daftar penyakit yang dapat didiagnosis dengan menggunakan teknologi ini diberikan di bagian analisis

Mengapa penyakit metabolik perlu didiagnosis sedini mungkin?

Banyak dokter secara keliru percaya bahwa NBO sangat langka sehingga perlu dikeluarkan hanya sebagai upaya terakhir, dan seringkali diagnosis yang benar dibuat di kemudian hari atau penyakit tidak terdiagnosis sama sekali.

Akan tetapi, lebih dari 150 bentuk NBO telah dikenal dengan metode terapi yang efektif telah dikembangkan dan kehidupan serta kesehatan pasien sangat bergantung pada seberapa cepat dan benar diagnosis dibuat. Untuk 20 penyakit yang dapat didiagnosis menggunakan TMS, pengobatan khusus telah dikembangkan. Diagnosis tepat waktu - menyelamatkan nyawa dan kesehatan pasien!

Pengumpulan sampel darah

Darah diambil menggunakan kartu penyaring standar (No. 903), yang digunakan untuk menyaring bayi baru lahir untuk PKU. Darah dapat berupa kapiler (dari jari, tumit) dan vena. Anda harus menjenuhkan seleksi dengan baik dengan filter! Kartu filter harus dengan jelas menunjukkan nama lengkap, oleh siapa dan dari mana pasien dikirim, tanggal lahir dan nomor telepon dokter yang merawat. Sampel dikeringkan dengan udara selama 2-3 jam. Dianjurkan untuk melampirkan ekstrak dari riwayat kesehatan.